《核酸类药物的分析》ppt课件

1、第九章第九章 核酸类药物的分析核酸类药物的分析根本要求根本要求掌握：核酸的构造和分类；嘌呤类药物掌握：核酸的构造和分类；嘌呤类药物和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的原理原理熟习：核酸的理化性质；反义寡核苷酸熟习：核酸的理化性质；反义寡核苷酸药物鉴别、检查、含量测定的原理药物鉴别、检查、含量测定的原理第一节第一节 概述概述构造和分类构造和分类理化性质理化性质1869年核酸最早分别自外科绷带脓细胞的细胞核，当时发现这种物质含磷量之高超越当时发现的任何一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。1909年其组成被研讨清楚，1944年生物功能初步廓清，在X射线衍射技术

2、支持下1953年构造廓清。核酸是脱氧核糖核酸DNA与核糖核酸RNA的通称。核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解一、构造和分类一、构造和分类核核 酸酸代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖； 代表碱基 代表磷酸基磷酸碱基戊糖NNNNNHHNHNHOOOOHOHOHOHCH2POHOOO碱基衔接糖苷键碱基衔接糖苷键对对DNA为为H核糖(in RNA)2脱氧核糖(in DNA)核苷核苷DNA & RNA 嘧啶环嘧啶环 嘌呤环嘌呤环类别类别DNARNA根本单位根本单位脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷

3、酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸 鸟嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸碱基碱基腺嘌呤腺嘌呤A) 鸟嘌呤鸟嘌呤G) 胞嘧啶胞嘧啶C) 胸腺嘧啶胸腺嘧啶T) 腺嘌呤腺嘌呤A) 鸟嘌呤鸟嘌呤G) 胞嘧啶胞嘧啶C) 尿嘧啶尿嘧啶U 五碳糖五碳糖脱氧核糖脱氧核糖 核糖核糖酸酸磷酸磷酸 磷酸磷酸 嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤。 嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶 都是根本碱基的化学修饰型。NNNNONH2H鸟嘌

4、呤鸟嘌呤NNNNOH次黄嘌呤次黄嘌呤CH31-甲基次黄嘌呤甲基次黄嘌呤二、理化性质二、理化性质一两性性质：磷酸基；碱基通常：酸性一两性性质：磷酸基；碱基通常：酸性 pH pH影响碱基间氢键稳定：影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.011.0DNA pH4.011.0二水解性：微溶于水，不溶于普通的有机溶剂二水解性：微溶于水，不溶于普通的有机溶剂三三UVUV：max=260nm max=260nm 蛋白质蛋白质280nm280nm A260/A280 A260/A280 纯纯DNADNA1.81.8 纯纯RNARNA应到达应到达2.02.0 混有杂蛋白混有杂蛋白 比值降低比值降低四变性和复性四变

5、性和复性1.变性：在某些理化要素影响下，变性：在某些理化要素影响下，DNA双螺旋区双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋构造变成单链无规律的构造变成单链无规律的“线团，但不发生共价键线团，但不发生共价键的断裂，这过程称之。的断裂，这过程称之。变性缘由：高温普通变性缘由：高温普通75、强氧化剂、强、强氧化剂、强酸、碱、尿素等；酸、碱、尿素等；机理：双链间氢键断开，成为两条单链机理：双链间氢键断开，成为两条单链 DNA双双螺旋二级构造的破坏，生物活性的丧失螺旋二级构造的破坏，生物活性的丧失特征性特征性Tm-DNA的变性温度的变性温度 82952

6、.复性复性一定条件下，去除变性要素后，核酸恢复二级构一定条件下，去除变性要素后，核酸恢复二级构造及生物活性的景象；通常运用热复性。退火造及生物活性的景象；通常运用热复性。退火五颜色反响五颜色反响苔黑酚反响苔黑酚反响:RNA中核糖中核糖+浓浓HCl浓浓H2SO4糠醛糠醛+苔苔黑酚黑酚深绿色化合物深绿色化合物 max=670nm 二苯胺反响二苯胺反响:DNA中脱氧核糖中脱氧核糖+浓浓H2SO4 5-羟基羟基-4-羰基羰基戊醛戊醛+二苯胺二苯胺蓝色化合物蓝色化合物 max=595nm 水解后磷酸：水解后磷酸：磷酸磷酸+钼酸钼酸磷钼酸磷钼酸+复原剂维生素复原剂维生素C、氯、氯化亚锡等化亚锡等 钼蓝钼蓝

7、 max=660nm Fe3+脱水脱水第二节第二节 嘌呤类核苷酸药物分析嘌呤类核苷酸药物分析l嘌呤碱腺嘌呤、鸟嘌呤嘌呤碱腺嘌呤、鸟嘌呤l戊糖戊糖l磷酸磷酸一、鉴别一、鉴别戊糖鉴别戊糖鉴别嘌呤鉴别嘌呤鉴别磷酸鉴别磷酸鉴别特征吸收光谱特征吸收光谱熔点测定熔点测定一戊糖的鉴别一戊糖的鉴别苔黑酚反响地衣酚反响苔黑酚反响地衣酚反响-凡核糖均有此反响凡核糖均有此反响试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁催化剂试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁催化剂景象：鲜绿色景象：鲜绿色二苯胺反响二苯胺反响 DNA试剂：浓硫酸，二苯胺试剂：浓硫酸，二苯胺景象：蓝色景象：蓝色与间苯三酚反响核苷酸中的戊糖与间苯三酚反响核苷酸中的

8、戊糖景象：玫瑰红色景象：玫瑰红色二嘌呤的鉴别二嘌呤的鉴别+氨制硝酸银氨制硝酸银白色白色红棕色遇光红棕色遇光嘌呤碱基的特殊鉴别反响嘌呤碱基的特殊鉴别反响三磷酸的鉴别三磷酸的鉴别有机磷有机磷无机磷无机磷+ +钼酸钼酸磷钼酸磷钼酸+ +复原剂复原剂钼蓝钼蓝四特征吸收光谱四特征吸收光谱lUV：嘌呤环，嘧啶环lIR五熔点测定五熔点测定二、检查二、检查普通检查普通检查酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和廓清度和廓清度蛋白质检查蛋白质检查磺基水杨酸溶液磺基水杨酸溶液有关物质有关物质纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查三、含量测定三、含量测

9、定紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法如今国家曾经同意的嘌呤类核苷酸药物如今国家曾经同意的嘌呤类核苷酸药物普通都用普通都用此法测定含量此法测定含量HPLCHPLC四、实例分析四、实例分析肌苷肌苷ATP一肌苷的质量分析一肌苷的质量分析1.构造：构造：C10H12N4O5 268.23本品为本品为9-D-核糖次黄嘌呤。按枯燥品计算，核糖次黄嘌呤。按枯燥品计算，含含C10H12N4O5应为应为98.0102.0。2.性状：性状：本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐在稀盐酸和氢氧化钠

10、溶液中易溶。酸和氢氧化钠溶液中易溶。3.鉴别鉴别取取0.01供试品溶液适量供试品溶液适量,加等体积的加等体积的3,5-二二羟基甲苯溶液羟基甲苯溶液(取取3，5-二羟基甲苯与三氯二羟基甲苯与三氯化铁各化铁各0.1g，加盐酸使成，加盐酸使成100ml)，混匀，混匀，在水浴中加热约在水浴中加热约10分钟，即显绿色。分钟，即显绿色。-苔黑酚反响苔黑酚反响取本品取本品1水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，即产生白色胶状沉淀。即产生白色胶状沉淀。-嘌呤碱基嘌呤碱基 取含量测定项下的溶液取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，照分光光度法测定，在在248nm的波优点有最大吸收，在的波

11、优点有最大吸收，在222nm的波优点有最小吸收。的波优点有最小吸收。色谱图色谱图IR4.4.检查检查溶液的廓清度与颜色溶液的透光率取本品溶液的廓清度与颜色溶液的透光率取本品0.5g0.5g，加水，加水50ml50ml使溶解，照分光光度法在使溶解，照分光光度法在430nm430nm的波优点测定透光率，不得低于的波优点测定透光率，不得低于98.098.0( (供注射用供注射用) )。枯燥失重取本品，在枯燥失重取本品，在105105枯燥至恒重，减失枯燥至恒重，减失分量不得过分量不得过1.01.0炽灼残渣不得过炽灼残渣不得过0.10.1( (供注射用供注射用),),或不得过或不得过0.20.2( (供

12、口服用供口服用重金属取本品重金属取本品1.0g1.0g，依法检查含重金属不得过，依法检查含重金属不得过百万分之十。百万分之十。 次黄嘌呤精细称取本品次黄嘌呤精细称取本品0.5g0.5g，置，置50ml50ml量瓶中量瓶中, , 加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法实加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法实验，汲取上述溶验，汲取上述溶10l10l，点于，点于3 325cm25cm色谱滤纸色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约上，照上行法，以水为展开剂，展开约20cm20cm处，处，取出晾干，置紫外光灯取出晾干，置紫外光灯(254nm)(254nm)下检视，不得下检视，不得出现杂质斑点。出现

13、杂质斑点。 HPLCHPLC5.5.含量测定含量测定1 1UVUV法：取本品，精细称定，加水制成每法：取本品，精细称定，加水制成每1ml1ml中约含中约含10g10g的溶液，照分光光度法在的溶液，照分光光度法在248nm248nm的波优点测定吸收度，按的波优点测定吸收度，按C10H12N4O5C10H12N4O5的吸收系数的吸收系数E1E11cm1cm为为460460计算。计算。2 2HPLCHPLC6.6.作用与用途辅酶类药。有改善机体代谢作作用与用途辅酶类药。有改善机体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、

14、细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等。视神经萎缩等。7.7.用法与用量口服，一次用法与用量口服，一次0.20.20.6g0.6g一日一日0.60.61.8g1.8g8.8.贮藏遮光，密闭保管。贮藏遮光，密闭保管。9.9.制剂制剂(1)(1)肌苷口服溶液肌苷口服溶液(2)(2)肌苷片肌苷片(3)(3)肌肌苷注射液苷注射液 (4) (4)肌苷胶囊肌苷胶囊(5)(5)肌苷颗粒剂肌苷颗粒剂二三磷酸腺苷二钠二三磷酸腺苷二钠ATP的质量分析的质量分析 拼音名：拼音名：Sanlinsuanxianganerna Sanlinsuanxianganerna 英文名：英文名：Adenosine

15、Disodium TriphosphateAdenosine Disodium Triphosphate C10H14N5Na2O13P3 551.15 C10H14N5Na2O13P3 551.151.1.构造：本品为腺嘌呤核苷构造：本品为腺嘌呤核苷-5-5-三磷酸酯二钠三磷酸酯二钠盐三水化合物。按枯燥品计算，含盐三水化合物。按枯燥品计算，含C10H14N5Na2O13P3C10H14N5Na2O13P3不得少于不得少于90.090.0。2.2.性状：本品为白色或类白色粉末或结晶性状：本品为白色或类白色粉末或结晶块状物；无臭，味咸；有引湿性。块状物；无臭，味咸；有引湿性。 本品本品在水中易溶

16、，在乙醇、氯仿或乙醚中几在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。乎不溶。 3.3.鉴别鉴别1 1取本品取本品20mg,20mg,加稀硝酸加稀硝酸2ml2ml溶解后，加钼酸溶解后，加钼酸铵试液铵试液1ml1ml，加热，放冷，即析出黄色沉淀。，加热，放冷，即析出黄色沉淀。- -磷酸盐磷酸盐2 2取本品约取本品约10mg10mg，加盐酸溶液，加盐酸溶液(12)5ml(12)5ml溶溶解后，加间苯三酚解后，加间苯三酚10mg10mg，混匀，置水浴中加热，混匀，置水浴中加热约约1 1分钟，即显玫瑰红色。分钟，即显玫瑰红色。-戊糖戊糖3 3苔黑酚反响苔黑酚反响戊糖戊糖 3 3UVUV4 4IRIR5 5

17、本品的水溶液显钠盐的鉴别反响本品的水溶液显钠盐的鉴别反响4.4.检查检查酸度酸度溶液的廓清度与颜色溶液的廓清度与颜色蛋白质取本品蛋白质取本品20mg20mg，加水，加水2ml2ml溶解后，滴加溶解后，滴加3030磺基水杨酸溶液磺基水杨酸溶液0.5ml0.5ml，不得发生浑浊。，不得发生浑浊。有关物质有关物质水分水分氯化物氯化物铁盐铁盐重金属重金属热原热原5.5.含量测定含量测定1 1总核苷酸：总核苷酸：UVUV2 2三磷酸腺苷二钠的分量比：三磷酸腺苷二钠的分量比：HPLCHPLC3 3色谱条件与系统适用性实验色谱条件与系统适用性实验4 4测定法测定法6.6.作用与用途辅酶类药。用于进展性肌作用

18、与用途辅酶类药。用于进展性肌萎缩、脑溢血后遗症、心功能不全、心萎缩、脑溢血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。肌疾患及肝炎等。7.7.留意缓慢注射。心肌硬塞和脑溢血在留意缓慢注射。心肌硬塞和脑溢血在发病期患者慎用。发病期患者慎用。8.8.贮藏有阴凉枯燥处密封保管。有效期贮藏有阴凉枯燥处密封保管。有效期年。年。9.9.制剂制剂(1)(1)三磷酸腺苷二钠注射液三磷酸腺苷二钠注射液(2)(2)注射用三磷酸腺苷二钠注射用三磷酸腺苷二钠 第三节第三节 嘧啶类核苷酸药物的分析嘧啶类核苷酸药物的分析一、鉴别一、鉴别 该类药物的化学组成和性质本与嘌呤类类似，独一区别在于碱基的不同。一元碱二、检查二、检查常规

19、检查常规检查其他核苷酸：其他核苷酸：TLCTLC三、含量测定三、含量测定UVUV法法电位滴定法电位滴定法四、实例分析四、实例分析-氟尿嘧啶氟尿嘧啶1.1.通用名通用名: : 氟尿嘧啶氟尿嘧啶 化学名化学名: 5-: 5-氟氟-2,4(1H,3H)-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮嘧啶二酮分子式分子式: C4H3FN2O2 : C4H3FN2O2 分子量分子量: 130.08 : 130.08 熔熔 点点: 278-286 : 278-286 水溶性水溶性: 12.2g/L 20: 12.2g/L 20含氟尿嘧啶含氟尿嘧啶C4H3FN202C4H3FN202应为标示量的应为标示量的93.0-107

20、.0% 93.0-107.0% 2.2.性状：性状：白色或类白色结晶或结晶性粉末。白色或类白色结晶或结晶性粉末。在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中几乎不在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中几乎不溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。3.3.鉴别鉴别1 1+ +溴，溴褪色；溴，溴褪色；+ +氢氧化钡，紫色氢氧化钡，紫色2 2三氧化铬的饱和硫酸溶液，均匀涂于三氧化铬的饱和硫酸溶液，均匀涂于管壁管壁 本品，不能再均匀涂于管壁本品，不能再均匀涂于管壁3 3max=265nm min=232nmmax=265nm min=232nm4 4IRIR4.4.检查：检查：氯化物氯化

21、物硫酸盐硫酸盐含氟量含氟量枯燥失重枯燥失重重金属重金属5.5.含量测定：取本品适量，加含量测定：取本品适量，加0.1mol/L0.1mol/L盐盐酸溶液制成每酸溶液制成每1mL1mL中约含中约含10g10g的溶液，的溶液，照紫外照紫外- -可见分光光度法，在可见分光光度法，在265nm265nm波优波优点，测定吸光度，按点，测定吸光度，按C4H3FN2O2C4H3FN2O2的吸收系的吸收系数数E1%1cmE1%1cm为为552552计算，即得。计算，即得。 用途：本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代用途：本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰核苷核，干扰DNADNA合成。对合成。对RNARNA的合成也有的合成也有一定的抑制造用。一定的抑