圆二色谱研究Asp44在稳定肌红蛋白结构中的作用

1、木文由lywbetty贡献pdf文档可能在wap端浏览体验不佳。建议您优先选择txt,或下载源文件到木机杳看。 笫2 8卷，笫2期光谱学与光谱分析2 0 0 8年 2 月spect ro scopy and spect ral analysis圆二色谱研究asp44在稳定肌红蛋白结构屮的作用王静云1 ,刘 1 ,唐 1,2,包永明1 ,郑学仿2 ,安利佳1丹乾11大连理工大学环境生命学院，辽宁 大连 11602421辽宁省高校生物有机重点实验室，大连大学，辽宁大连 116622引言蛋白结构的稳定及正确的折替是它们执行各种生物功能二硫键、盐键、氢键及内在 二级结构的倾向性对蛋白结构的稳定至关重要

2、1,2。长期以来人们认为蛋白表面的 氨基酸残基暴露在溶剂中，对蛋白的稳定性影响甚微。但最近几年硏究成果对这一观念 捉出了质疑,发现蛋白表面带电氨基酸残基对蛋白的稳定性及性质具冇非常大的影响， 从而开辟了通过优化蛋白表面电荷与电荷的作用來调节蛋白结构稳定性及功能的新思路 325 o肌红蛋口 ( mb)是llj一条含有153个氨基酸残基的多肽链和辅基血红素组成 的。在生物体中担负着重要的储存氧和促进氧在细胞中扩散的生理功能6 。尽管冇 关氨基酸残基对肌红蛋白稳定性及性质的影响已有很多报道，但大都集屮在研究抹香鲸 肌红蛋白血红素周围氨基酸或疏水氨基酸的作用729 。作者前期的研究10 发现 当将马心

3、肌红蛋白表而44位 氨基酸从天冬氨酸突变为赖氨酸后，突变肌红蛋白与细胞色 素b5之间的电了转移速率提高了一个数量级，但这一蛋白表血氨基酸对马心肌红蛋白结 构稳定性的作用未见报道。各 种光谱学的方法是研究蛋白结构、功能的重要手段 11214 ,由于圆二色谱法可以研究在不同条件下蛋白二级结构折叠状态 收稿日期： 2006211218 ,修订日期:2007202226的基础。大量的实验结果及理论计算表明：疏水核的堆积、基金项目：国家自然科学基金项目(20271010)和教冇部留学归国人员启动基金项目 资助作者简介：王静云，女，1967年生，大连理工大学环境生命学院副教授 2mai1 : wangji

4、ngyun dl 1 cn e摘 要 为了了解肌红蛋白mb分子表面44位天冬氨酸对稳定肌红蛋口结构的影 响，用pcr定点突变的技 术将肌红蛋111 (mb)基因上的第44位天冬氨酸的密码子ga t 突变成赖氨酸的密码子aaa,获得突变体d44k基因，将突变体棊因克隆在肌红蛋白表达 质粒p gym上,转化犬肠杆菌bl21 ,突变蛋白d44k在人肠杆菌屮人量表达，收集菌 体。酶法裂解细菌，依次用硫酸鞍沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化得 突变肌红蛋口 d44 ko用圆二色谱分别研究野牛型肌红蛋口及具突变体(d44k)的耐热及 耐酸的变性过程。实验结果表明：用碱性氨基酸lys取代酸性氨基酸as

5、p44残基，增 强了肌红蛋白耐热变性能力，导致蛋白质的热变性中点温度tm由711 9 °c增加到751 1 °c,但对肌红蛋白耐酸变性的能力影响不大。关键词 肌红蛋白;定点突变；圆二 色谱；蛋白质结构；结构稳定性中图分类号：q5181 4 文献标识码：a文章编号:100020593 (2008) 0220426204的变化15217 ,因此为了进一步探讨蛋白表面氨基酸在蛋白质结构稳定性屮发挥 的作用，本文用圆二色光谱初步探讨马心肌红蛋口突变体d44 k的蛋口结构稳定性。1 实验部分dna连接酶、dna聚合酶、t和bam h t限制性内切酶等pst购白人连宝牛物公司。含有编码

6、野空型马心肌红蛋口基因的表达质粒pgym ,由美国nort hwestern u niversi ty , bl ml hoff man教授惠赠。其他化学试剂均为分析纯, 所有的溶液均用millipore q水配制。实验仪器：圆二色谱仪(j asco j2810 spect ropolarimeter ),温度控制器(q j ulabo temperat ure con2 t roller) , j ascov2560 uv2vis spect rop hoto meter ,蛋 白分离 层析系统 a kta explo rer 100 ( pharmacia)。 11 2 实验方法11 21

7、 1突变蛋白(d44 k)的制备 设计突 变引物l ys442mb2f 5'ggc gtc t ga a a a act gaa aaa a 3' l ys442mb2r 5z ttttttgagt, t t t tca gac gcc 3用pcr定点突变的方法构建肌红，蛋白d44 k突变基因，含有突 变基因的质粒转染至bl21 ( d e3)中，使突变蛋白获得大量表达，随后的蛋白 纯化按文11 1试剂和仪器试剂：野生型马心肌红蛋白购自美国sigma公司。t4vol 1 28 ,nol 2 ,pp4262429 february , 2008第2期光谱学与光谱分析献8 进行。野

8、牛型及突变休肌红蛋口浓度的确定利用摩尔消光系数£ = 157 mmol ? - 1 ? - 1 10 o l cm 409用10 mmol ? - 1 , p h 81 0的磷酸钠缓冲液配制蛋口质l溶液,实 验釆用圆二色谱仪(j asco j2810 spect ropolarimeter equipped wi t h a j ulabo temperat ure cont roller)研究肌红蛋白及其突变体去折叠过程，分别使用厚度为01 1和1 cm 的样 品池测定波长范围195250 nm (蛋白浓度10 n mol ? - 1 )及l 250550 nm (蛋 白浓度20

9、nmol ? - 1 )的cd光谱，温度范l围为2090 °c,每次在测量温度下温 冇15 min ,扫描速度100 nm ? min - 1。每一个温度下扫描3次。11 21 3 酸性 p h介导的肌红蛋白及其突变体去折叠研究用不同p h乙酸钠缓冲溶液(01 2 mol ? - 1 , p h 21 5l u 61 2)配制蛋白质溶液(10 mol ? - 1 ),室温下放置11 5 h后，l测 定cd光谱，方法同11 21 2 011 21 2 热诱导的肌红蛋白及其突变体去折叠研究4272结果与讨论谱图1 (a)是远紫外区肌红蛋白突变体(d44 k)在温度为20 , 65 , 8

10、0 , 90 °c的 圆二色散光谱，野生型肌红蛋白显示与之相似的cd光谱(数据未列出)。21 1温度对肌红蛋口及具突变体结构稳定性影响的cd光eigl 1 spectra ofthe mutant mb( d44 k) from cd(a) : 195250 nm ; (b) : 250550 nm ; 1 : 20 °c; 2 : 65 °c; 3 : 80 °c; 4 : 90 °c20 to 90 °c 195250 nm and 250550 nm从图1 (q可以看到：随着温度的不断上升，肌红蛋白及 其突变体在222 nm处的

11、 负峰强度逐渐降低，在90 °c , 222时nm处的负峰基本消失,同时209 nm处负峰随温 度升高其强度也降低，在90 °c蓝向移动至206 nm ,这些结果说明肌红蛋口及其突变 体的二级结构中a 2螺旋，p 2折叠的含量随温度 升高明显下降。1 (b)列出肌红蛋白 突变体(d44 k)在不同图温度下250500 nm的cd光谱，而野生型的光谱与之类似。 其中265和295 nm的cd峰与芳香氨基酸残基处在特定的蛋白三维结构中有关，而 409 nm处的cd峰反映了辅基血红素基团与肽链的结合悄况18 。从图1 ( b )发 现随着温度的升高，肌红蛋白突变体在409 nm处

12、的峰强度降低，表明辅基血红素随着 温度的提高，逐渐脱离蛋口肽链，在90 时峰基本消失，血红素辅基此时完全脱离 了肽链。同吋由丁蛋白在265和295 nm的峰强度也随温度的提高而降低,表明温度 的提高引起肌红蛋片的三维结构的变化,导致肽链中芳香氨棊酸在空间位置的变化。而 从图2列出的肌红蛋白及具突变体(d44 k)在222和409 nm的cd峰强度变化规律|11| 线可知，随温度的升高，辅基血红素与肽链的解离伴随着a 2螺旋结构的展开。 按照二态机制模拟计算肌红蛋白及其突变体的热力学参0数。用蛋白质溶液在222 nm处 摩尔椭圆度()拟合，得到的figi 2 transitional curve

13、s of the cd spectra on heating at 222 and 409 nm1 : 409 nm ; 2 : 222 nm (a) : wild2t ype mb ; ( b) : the mutant mb (d44 k);428光谱学与光谱分析第28卷变性中点温度tm值以及a hm, asm等热力学参数列于表1中。根据222 nm处的椭圆率值，应用文献19屮公式求出不同温度下的热变性平衡帘数及反应自由 能(1) kd 二(x 20 - x t ) / ( x t - x 90 ) ag = - r t 1 n kd ( 2)时式屮 x 20 , x 90和x t分别是2

14、0 , 90和t °c 222 nm的椭圆a率，因为在蛋白解链温度附近， ag = ah - t s ,用 ag 对 t 作图，nj 以求得 a h 和 as,当 kd = 1 , ag = 0 , a h/ as =tm ,这个温度是蛋白质的解链温度，用tm表示，并用它來衡量蛋口质的热稳定性otable 1defolding thermodynamic parameters of mb and its mutant upon heating肌红蛋白野生型d44 kt m / °c a h m/ ( kj ? mol - 1 ) asm/ ( kj ? mol 1k - 1

15、 )由表1可以看出突变体对热稳定性较野生型较强，说明肌红蛋白的第44位天冬氨 酸用赖氨酸代替增强了肌红蛋白结构的热稳定性。21 2 酸变性对肌红蛋白及其突变体 结构稳定性影响的cd光谱图3是肌红蛋白及其突变体(d44 k)在远紫外cd光谱中 222 nm处的椭圆率随p h值变化的曲线。从图3对见两蛋白受酸诱导变性规律十分相 似，两蛋白在p h范围为41 2561 5时，222 nm处的椭圆率的变化不明显，说明蛋 口的二级结构变化不大。但当ph低于4时，肌红蛋口及其突变体(d44k)在222 nm处的椭圆率快速降低，蛋白在酸的介导下开始变性，导致。2螺旋结构含量的减 少。为了精确知道蛋白对酸变性

16、的耐参考education press (北京:高等教育出版社),2002. 252. 12825. (10) : 3564.1 makhatadze g i , privalov p l . protein chem. , 1995 , 47 : 307.2 ulrich arnold , cindy schulenburg , doreen schmidt , et al . biochemist ry , 2006 , 45 : 3580. 3 marshall s a , morgan c s , mayo s l . j . mol . biol ., 2002 , 316 : 18

17、9. 5 lee c f , makhatadze g i , wong k b. biochemist ry , 2005 , 44 : 16817. 4 schwehm j m , fitch c a , dang b n , et al . biochemist ry , 2003 , 42 : 1118.6 wan g jing2yan , zhu sheng2geng , xu chang2fa (王镜岩，朱圣庚，徐 长班).biochemist ry ( third edition)(生物化学，第 3 版).higher 7 hargrove mark s , olson jo h

18、n s. biochemistry, 1996, 35 : 11310. 8 wan lianglu , twi tchett mark b , eltis lindsay d , et al . proc, of national academy science of t he united state of america , 1998 , 95 : 9 wiliam c b regis , j uliana fattori , marcelo m santoro , et al . archives of biochemist ry and biop hysics , 2005 , 43

19、6 : 168.10 hoff man brian m , celis laura , cull deborah a , et al . proc, of national academy science of t he united state of america 2005 , 10211 yan zheng2yu , shao xiu2fen , j ian g xin2min , et al (严拯宁，邵 秀芬，姜新民,等） spect ro scopy and sped ral analysis （光谱学与光谱分析），2006 , 26 （8） : 1494.12 wan g jin

20、g2yun , p en g xiao2jun , yan g dong , et al （王静云,彭孝军，杨，等） spect ro scopy and spect ral analysis （光谱学与光 冬谱分析），2001 , 21 （5） : 701.711 9 751 11211 77 1201 601 353 01 346受能力，通常用使50 %蛋口去折叠时的p ii 1/ 2值表示，此值越低，表明蛋白越 耐酸变性。因此我们参照文献20计算肌红蛋白及其突变体在酸诱导条件 下冇关热力学参数（见表2）。2数据显示突变体（d44 k）的p h 1/ 2比野 生型略低，表分別为31 88和

21、31 95 ,但差别不十分明显。同时从反应自由能来看， 野生型肌红蛋白比（044 k）的ago小，也说明野生型 肌红蛋白较容易受酸的诱导而变 性。table 2 defolding thermodynamic paramcters of mb and its mutant upon acid2mcdiated donaturationp h 1/ 2 31 95 31 88文figi 3acid dependence of the mean residue ellipticity at 222 ture was keptat 25 °c1 : mb （d44 k） ; 2 : mb肌

22、红蛋白野生型d44 k献nm of myoglobin and its mutant mb（ d44 k） 1 all solu2 tion contains 01 2 mol ?l -1 acetate bufferl tempera2ago / （ kj ? - 1 ） mol 661 946 691 318第2期光谱学与光谱分析13 zelent b , yano t , ohisson p i , et al . biochemist ry , 2005 , 44 : 15953. 14 sha yin21in , hu an g yong21iang （沙印林，黄永亮）.acta p

23、hys. 2chim. sin.（物理化学学报）,2002 , 18（6） : 504.429probe of the effect of asp44 on the stab i 1 i ty of myoglob in by circular dichroism spectropolarimeter1. school of enviro nmental & life scienee , dalian u nivorsity of technology , dalian 116024 , china 2. liaoning key lab of bioorganic chemist r

24、y , dalian u niversity , dalian 116622 , china wan g jing2yunl , l tu dani , tan g qianl ,2 , bao yo ng2mingl , zh en g xue2fang2 , an li2jia 1zyme then t he mutant p rotein was p urified by ammo nium sulfate p recipitatio n , ion2exchange chro matograp hy and gel f ilt ratio n. little effect on it

25、s resistance to acid denat uration. keywords myoglo bin ; site2directed mutagenesis ; circular dichroism ; protein st ruct ure ; st ruct ure stabilityglobins' denat uration upon heating to determine t he unfolding t hermodynamic parameters of mb and it s mutant （ d44 k） the re2 suit s show t hat

26、 t he mutatio no f t he surfacc2charged residue asp44 to l ys44 can increase t he p rotein' stabi 1 i ty on it s resista nee s to heat , resulting in t he increase in t he p rote in， denat uriri£ mid2temperat ure by about 4 °c, f rom 711 9 to 751 1 °c, but shows st he code of asp4

27、4 , ga t , in t he gene of ho rse heart myoglobin was changed into aaa fo r l ys by pcr site2clirected mutagene2 sis. the mutant gene was ligated into pst 1/ bam h 12cut p gym and t he resulting plasmid was t ransfo rmed into e coli bl21. the circular dichroism spect ra were employed to mo nitor t h

28、e kinetic behavio rs of wild2type and mutant myoglobins' denat uration at different p hs or upon heating , and t he “two2state” model was used to simulate t he kinetic p rocess of wild2type and mutant myo2 mutant p rotein （ d44 k） was exp ressed in bl21 successf ully. the bacteria co ntaining mu