广泛存在于植物组织中,新鲜的水果、蔬菜,特别是枣、辣

1、维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。 维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190192，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。 根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有 （1）2，6-二氯靛酚法

2、（还原型VC） （2）2，4-二硝基苯肼法 （总VC） （3）碘量法 （4）荧光分光光度法 一、2，6-二氯靛酚滴定法 1、原理： 还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型 抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样 品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。 2、试剂 1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000ml； 2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000ml； 维生素C标准液：准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸

3、至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC； 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。 标定一：吸标液（VC）5ml于三角瓶加6%KI溶液0.5ml加1%淀粉3滴用0.001N KIO3标液滴定到淡兰色。 计算： 抗坏血酸浓度（mg/ml）= （V1 × 0.088）/ V2 V1 - 滴定时消耗0.001N KIO3标液的体积（ml） V2 -维生素C重量（g） 0.088 -1ml0.001N KIO3标液维生素C的量（mg/ml） 标

4、定二：吸5ml已知浓度V C标液 加5ml1%草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点 计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T） T= （C × V1）/ V2 C - 维生素C的浓度（mg/ml） V1 -维生素C的体积（ml） V2 -消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml） 0.001N KIO3标液：吸0.1N KIO3溶液5ml于500ml容量瓶内加水至刻度，每毫升相当于VC0.008mg； 0.5%淀粉溶液； 6%KI溶液； 3、操作方法 提取：称样50g加2%草酸100ml到入捣碎机中处理过滤颜色若深可加白陶土 滴定：吸5

5、ml样液于三角瓶用染料滴定至粉红色15秒内不褪色 计算： VC（mg/100g）=（V × T）/ W × 100 V -消耗染料体积（ml） T -1ml染料所能氧化维生素C的毫克数 W- 滴定时所有滤液中含有样品的克数 4、注意事项 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水； 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考； 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C； 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这

6、种情况的发生； 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化； 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除； 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。 荧光法 1原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。 2适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果

7、及其制品中总抗坏血酸的测定 3仪器 31实验室常用设备。 32荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。 33打碎机。 4试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。 （1）偏磷酸乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4冰箱可保存710天。 （2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。 （3）偏磷酸乙酸硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。 （4）50 乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa3H2O），加水至1000ml。

8、 （5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。临用前配制。 （6） 邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。 （7） 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。 变色范围：pH=1.2 红色 pH=2.8 黄色 pH4.0 兰色 （8） 活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流12h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110120烘箱中干燥，备用。 （9）标准 抗坏血酸标准溶液（1mg/

9、ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。 抗坏血酸标准使用液（100g/ml）: 取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。 标准曲线的制备：取下述"标准"溶液（抗坏血酸含量10g/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。 5.操作步骤 5.1 样品制备 全部实验过程应避光。 称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色

10、，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40100g/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。 5.2 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。 5.3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"标准"及"标准空白"。 5.4 各取5ml样品氧化液于2个50

11、ml容量瓶中，分别标明"样品"及"样品空白"。 5.5 于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4冰箱中放置2h，取出备用。 5.6 于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。 5.7 荧光反应 取"标准空白"溶液，"样品空白"溶液及（5.6）中"样品"溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中

12、加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。 6. 计算 X=（c×V/m）×F×(100/1000) 式中：X-样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g； c-由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，g/ml； m-试样质量，g； F-样品溶液的稀释倍数； V-荧光反应所用试样体积，ml。 例： 测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每ml含2.5g

13、、5.0g、7.5g及10.0g，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。 由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（g/ml），按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。 如：取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml 样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23g。 2.23×100× 50× 100 - -= 52（mg/100g） 2.138× 10 ×1000

14、7. 注意事项 7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。 7.2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。 7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。 2，4-二硝基苯肼法 1原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-

15、二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。 2适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。 3. 仪器 3.1恒温箱：37±0.5 3.2可见-紫外分光光度计 3.3打碎机 4试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。 4.1 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。 4.2 85%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。 4.3 2%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，

16、过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。 4.4 2%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。 4.5 1%草酸溶液：稀释500ml 2%草酸溶液到1000ml。 4.6 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。 4.7 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。 4.8 1mol/L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。 4.9 活性炭：将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中，回流12h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110烘箱中烘干。 4.10 标准 （1）抗坏血酸标准溶液（1

17、mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml 1%草酸溶液中。 （2）标准曲线绘制 加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。 取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20g/ml。 取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12g/ml。 按样品测定步骤形成脎并比色。 以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（g/ml）为横坐标绘制标准曲线。 5. 操作步骤 5.1样品制备 全部实验过程应避光。 5.1

18、.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 5.1.3将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。 5.2氧化处理：取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml 2%硫脲溶液，混匀。 5.3呈色反应 5.3

19、.1于三个试管中各加入4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5恒温箱或水浴中，保温3h。 5.3.2 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置1015min后放入冰水内。其余步骤同样品。 5.3.3 85%硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5ml85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 5.3.4 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm

20、波长测吸光值。 6. 计算 同荧光法。 7. 注意事项 7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。 7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。 7.3 试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。 碘滴定法 一、目的及原理 本试验是利用碘酸钾做氧化剂。即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾淀粉指示剂，用已知浓度的碘酸钾滴定。当碘酸钾滴入后即释放出游离的碘，此碘被维生素C还原，直至维生素C完全氧化后，再滴以碘酸钾液时，释放出的碘因无维生素C的作用，可使淀粉指示剂呈蓝

21、色，即为中点，其反应如下： KIO3 + 5KI + 6HCl6KCl + 3H2O + 3 I2 二、药品与器材 柑橘、鲜枣、洋葱、甘蓝、辣椒等。 碘酸钾、碘化钾、淀粉，2%盐酸。 研钵、烧杯、100ml容量瓶、0.5、2、5ml移液管、滴定管、漏斗、纱布、分析天平。 三、操作与步骤 1.试剂制备 （1）0.5%淀粉液：称取可溶性淀粉0.5g，用蒸馏水调成浆状，注入100ml蒸馏水，煮沸至透明状，冷后用棉花过滤。 （2）0.001N KIO3液：精确称取KIO3 0.3568g（KIO3预先在102烘2小时，在干燥器中冷却备用）， 准确配成1000ml，得到0.01N KIO3液。再稀释10倍即为0.001N。 2.样品试液的制备： 将果蔬样品洗净，用纱布拭干其外部所附着的水分，若样品清洁可不必洗涤。样