与肝癌细胞共培养的T淋巴细胞DNA羟甲基化的免疫细胞学研究

1、项目编号：国家级大学生创新计划项目申报书项目名称：与肝癌细胞共培养的T淋巴细胞DNA羟甲基化的免疫细胞学研究起止时间：2013.06-2014.06所在学院：右江民族医学院项目负责人：刘鑫指导教师：农嵩、李根亮填报日期：2013.5.13右江民族医学院学工处制 2013年制填报说明1、申报书适用于国家级大学生创新计划项目申报，申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要；2、申报书填写要求用A4纸打印。一式三份由各学院经初评签署意见后统一报送学工处，同时报送电子文档；3、未尽事宜，可另附材料说明；4、项目编号一项不填。一、基本情况项目名称与肝癌细胞共培养的T淋巴细胞DNA羟

2、甲基化的免疫细胞学研究所属学科表观遗传学申请金额 元起止年月 年 月至 年 月主持人姓名刘鑫性别男民族汉出生年月1990年 4月学号1520110101联系电导教师农嵩联系电话办公： 手机:主持人曾经参与科研的情况曾主持：细胞免疫反应中DNA羟甲基化图谱的研究 合同编号：QJCX201334项目类别：区级创新项目时间：2012.06-2013.12指导教师承担科研课题情况在研课题（主持）1. 基于5羟甲基胞嘧啶的中华绒螯蟹非浓缩核精子发生机制（31260635），2013.01-2016.12，国家自然科学基金项目2. 边境地区民族医科院校大学生正确人生观养成的教育对

3、策研究（2013JGA203），2013.03-2015.02，广西高等教育教学改革工程项目3. DNA甲基化在职业暴露致男性不育中的作用（YK2012002），2012.03-2015.02，右医博士科研启动项目指导教师对本项目的支持情况实验设备、场所等的保障、实验技术和方法及论文写作的指导等。项目组主要成员姓 名学号专业班级所在学院项目中的分工刘鑫15201101012011级护理学本科1班护理学院协调实验研究；论文写作；免疫定位和定量李春燕187786835202010级临床本科7班临床学院数据整理及分析比较尹加伟13201002092010级影像本科2班医学影像系负责收集相关材料，并撰

4、写论文。进行相关实验，细胞培养。二、项目研究的目的和主要研究内容1、研究的目的 通过免疫细胞学的方法研究与肝癌细胞共培养的不同培养阶段的T淋巴细胞DNA羟甲基化的变化，分析T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝细胞癌的相关性，为肝细胞癌与细胞免疫反应相关性的研究提供基础资料。2、主要内容（1）T淋巴细胞与肝癌细胞共培养；（2）不同共培养阶段的T淋巴细胞内DNA羟甲基化位点的免疫定位和定量；（3）比较不同共培养阶段T淋巴细胞DNA羟甲基化的变化，分析T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝细胞癌引起的细胞免疫反应的相关性。三、国、内外研究现状和发展动态（附参考文献）肝癌是高度恶性的肿瘤之一，患者死亡率高，我国每年死于

5、肝癌的患者占全世界肝癌死亡人数的一半左右。细胞免疫反应在防治肝癌发生方面起着重要的作用。在肝癌发生过程中，T淋巴细胞被激活后转化为淋巴母细胞，并迅速增殖、分化，其中一部分在中途停下不再分化，成为记忆细胞；另一些细胞则成为致敏的淋巴细胞，其中Tc有杀伤力，使外源细胞破裂而死亡。因此，细胞免疫不仅准确高效杀灭肿瘤细胞，还能激发机体产生抗肿瘤免疫反应，从而使免疫系统，发挥正常作用以杀死肿瘤细胞，并启动免疫监视，防止肿瘤的转移和复发。另外，临床上也可以通过提取病人体内不成熟的免疫细胞，在体外进行培养后，然后回输到病人体内，用于治疗肝癌。因此，研究细胞免疫与肝癌的相关性对于人类更好地的防治肝癌具有重要的

6、意义，也可为人类优化肝癌防治的免疫策略提供基础临床指导。在肝癌引起的细胞免疫反应中，大量效应T淋巴细胞表达多种细胞因子及其他功能蛋白，参与细胞免疫反应过程。而相关基因的表达与基因的羟甲基化密切相关，但有关肝细胞癌引起的细胞免疫反应过程中T淋巴细胞DNA羟甲基化的相关研究还未见报到1，2。DNA羟甲基化是最近三年来表观遗传学领域研究的新热点。DNA羟甲基化是一种复制后表观遗传修饰，是Tet（Ten-Eleven-Translocation，10-11易位) 蛋白催化下5甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）形成5羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hm

7、C）的结果。5hmC的研究由于2009年Tet蛋白催化5mC形成5hmC功能的发现而倍受关注1。5hmC被称为DNA的第6种碱基，它不仅参与DNA的去甲基化过程，还在激活基因的表达、活性的维持及干细胞重编程和多能性的维持方面起着重要的作用35。如果从DNA羟甲基化的角度入手，通过细胞培养和免疫细胞学的方法，比较不同共培养阶段T淋巴细胞DNA羟甲基化的变化，有望阐明T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝细胞癌引起的细胞免疫反应的相关性。研究结果可为肝细胞癌与细胞免疫反应相关性的研究提供基础资料。参考文献：1 Tahiliani M., Koh K.P., Shen Y.H., Pastor W.A. Ba

8、ndukwala H., Brudno Y., Agarwal S., Iyer L.M., Liu D.R., Aravind L., Rao A. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 J. Science, 2009, 324(5929): 930-935.2Song C.X., He C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base J. Epigenomics, 2011,

9、 3(5): 521-523.3 谭理. DNA羟甲基化在小鼠胚胎干细胞中的研究进展. 生物化学与生物物理进展, 2011, 38 (7): 611-614.4Branco M.R., Ficz G., Reik W., Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome J. Nat. Rev. Genet., 2012, 13(1): 7-13.5Stroud H., Feng S., Morey K.S., Pradhan S., Jacobsen S.E. 5-Hydroxymethylcytosine is

10、associated with enhancers and gene bodies in human embryonic stem cells J. Genome Biol., 2011, 12(6): R54.四、项目的创新点和特色T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝癌的相关性研究。五、技术路线、拟解决的问题及预期成果1、技术路线 分析T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝细胞癌引起的细胞免疫反应的相关性。淋巴细胞和肝癌细胞混合培养淋巴细胞单独培养不同培养阶段的T淋巴细胞DNA羟甲基化免疫定位与定量分析T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝细胞癌引起的细胞免疫反应的相关性。2、项目研究的主要问题不同共培养阶段的T淋巴细

11、胞内DNA羟甲基化位点的免疫定位和定量3、拟解决困难途径通过免疫细胞化学的方法，定位和定量不同共培养阶段的T淋巴细胞内DNA的羟甲基化。5、预期成果1、理论成果：阐明T淋巴细胞DNA羟甲基化与肝细胞癌引起的细胞免疫反应的相关性；2、总结研究报告，发表1篇论文。六、项目研究进度安排2013.06-2013.08 细胞培养2013.09-2014.01 细胞培养及免疫定位和定量2014.02-2014.06 撰写论文和作结题报告。七、已有基础1、 与本项目有关的研究积累和已取得的成绩5hmC对基因表达的调控功能及其他多种功能已在哺乳动物和人的神经组织和胚胎干细胞内得到了证实。一年来一直在跟踪该领域的研究动态，对相关领域研究进展十分熟悉；已提取分离了小鼠的T淋巴细胞；导师多年来一直从事表观遗传学相关研究。本立项是对之前从组蛋白及甲基化和羟甲基化表观遗传修饰角度研究的继续和深入。本立项运用的都是成熟的技术和方法或改良的成熟方法，且研究组成员都已掌握，导师也有多年相关研究经验。2、 已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法具有