基因重组及遗传分析

1、第五章第五章 细菌基因重组及遗传分析细菌基因重组及遗传分析基因重组（基因重组（gene recombination）是指不同来源的）是指不同来源的遗传物质通过转移和交换而重新组合的过程。高等遗传物质通过转移和交换而重新组合的过程。高等动植物和许多动植物和许多产产生生有性孢子的真核微有性孢子的真核微生物生物的基因重的基因重组都是通过有性世组都是通过有性世代代来完成。来完成。在细菌中，提供部分遗传在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称物质或少数基因的一方称为供体（为供体（donor），而获得），而获得基因的另一方称为受体基因的另一方称为受体（recipient）。）。第一节第一节 转化（转化

2、（Transformation）转化：转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的现而使受体的基因型和表型发生相应变化的现象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。 在实验室条件下，通常用在实验室条件下，通常用CaCl2、cAMP、低温培、低温培养养、PEG介导及电脉冲等方法转介导及电脉冲等方法转化化细细菌菌或其它微或其它微生物生物。细菌转化的过。

3、细菌转化的过程大体可分为三个阶段：程大体可分为三个阶段：感受态的出现感受态的出现DNA的吸附和进入的吸附和进入DNA的整合的整合1. 感受态的出现感受态的出现 感受态（感受态（competence）：）：是指受体是指受体菌菌细胞最容易接受外源细胞最容易接受外源DNA并使之不被并使之不被DNA酶降解的生理状态。酶降解的生理状态。一、转化过程和机制一、转化过程和机制 细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白（白（5-10 kD）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中

4、包括细胞壁自溶结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞表面的素。自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与使其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌表面出现许多结合的活性。因此，当细菌表面出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。 4. 进入细胞的单链与进入细胞的单链与寄主寄主DNA同源区重组同源区重组并整合到染色体上并整合到染色体上革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌1. 双链双链DNA片段在片段在DNA结合蛋白（黑结合蛋白（黑色点）的帮助下吸附到细胞表面并由色点）的帮助下吸附到细胞表面并

5、由核酸酶（紫色椭圆）切成缺口核酸酶（紫色椭圆）切成缺口2. 由核酸酶降解由核酸酶降解其中一条单链其中一条单链3. 未被降解的单链与未被降解的单链与感受态特异蛋白相互感受态特异蛋白相互作用并进入细胞作用并进入细胞2. DNA的吸附和进入的吸附和进入 在流感嗜血在流感嗜血菌菌中，其感受态细中，其感受态细胞形成一种结合双链胞形成一种结合双链DNA的的膜结构，称为转化小体膜结构，称为转化小体（transformasome）。该小体）。该小体吸附吸附DNA后，与细胞的内外后，与细胞的内外膜相融合而转入细胞内侧，再膜相融合而转入细胞内侧，再将双链变成单链将双链变成单链DNA。 转化小体转化小体双链双链DN

6、A被转被转化小体摄取化小体摄取转化的双链转化的双链DNA（30-50kb）结合）结合到膜受体上到膜受体上很快进行同源重组很快进行同源重组使外源使外源DNA整合到整合到染色体上染色体上革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌DNA在进入感受态细胞在进入感受态细胞之之前，要经过可逆性吸附和不可逆性前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。吸附。可逆吸附的可逆吸附的DNA对对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附不可逆吸附DNA对对DNA酶不敏感。酶不敏感。吸附到细胞表面是双链

7、吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链，而不是单链DNA实验证明：实验证明：肺炎链球菌的转化因子在肺炎链球菌的转化因子在100下逐渐失去转化下逐渐失去转化活性活性(DNA发生变性发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链单链DNA复性成双链复性成双链)。说明完整的说明完整的DNA双链结构对于转化活性来说是必要的，转双链结构对于转化活性来说是必要的，转化的第一步，需要双链化的第一步，需要双链DNA才能结合到细胞表面的结合位才能结合到细胞表面的结合位点上。点上。当当DNA吸附后，被酶解开成单链吸附后，被酶解开成单链DNA，只有单链，只有单链DNA才才能进入细胞内并与

8、受体染色体能进入细胞内并与受体染色体DNA进行整合。进行整合。 流感嗜血菌特异性摄取序列：流感嗜血菌特异性摄取序列： 5AAGTGCGGTCA 3淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5GCCGTCTCAA 3在流感嗜血菌的染色体上有在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有列虽然只有10-12bp，但很少随机地出现在其他物种的，但很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。的吸收具有选择性。为什么有些细菌对摄取的为什么有些细菌对摄取的DNA有特异性要求呢？有特异性要

9、求呢？近年来的研究表明，近年来的研究表明，G-菌和菌和G菌对单链菌对单链DNA也能进行有效也能进行有效转化，但一般是在较低的转化，但一般是在较低的pH值下进行的。值下进行的。外源外源DNA片段在受体细片段在受体细胞中的命运：外源胞中的命运：外源DNA（红色）（红色）转化到受体细转化到受体细胞后，通过同源重组整胞后，通过同源重组整合到染色体上，否则被合到染色体上，否则被降解成核苷酸。降解成核苷酸。 3. DNA的整合的整合 转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要界中基因交换

10、的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。作用。转化的效率决定于下列三个内在因素：转化的效率决定于下列三个内在因素： 受体细胞的感受态，决定转化受体细胞的感受态，决定转化DNA能否进入细胞能否进入细胞 受体细胞的限制系统，决定转化受体细胞的限制系统，决定转化DNA在整合前是否被分解在整合前是否被分解 供体和受体供体和受体DNA的同源性，决定转化的同源性，决定转化DNA的整合。由于转的整合。由于转化化DNA总是与顺序相同或相似的受体总是与顺序相同或相似的受体DNA配合，所以亲缘配合，所以亲缘关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。二、人工转化二、

11、人工转化 1. 通过二价阳离子处理，大肠杆菌等部分通过二价阳离子处理，大肠杆菌等部分G-细菌能产生细菌能产生感受态感受态2. 通过制备原生质，大多数细菌特别是某些通过制备原生质，大多数细菌特别是某些G+细菌细菌 已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经人工诱导可使它们形成感受态。如：人工诱导可使它们形成感受态。如：1970年年Mandel和和Higa首先发现首先发现DNA在含有高浓度在含有高浓度Ca2+的条的条件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其

12、转化诱导的人工转化的大肠杆菌中，其转化DNA必须是一种独必须是一种独立立DNA复制子。复制子。1. 大肠杆菌的转化大肠杆菌的转化随着研究技术的改进和经验的积累，人们已经建立了用随着研究技术的改进和经验的积累，人们已经建立了用Ca2+、Mg2+等诱导转化的标准程序，能对大肠杆菌菌株等诱导转化的标准程序，能对大肠杆菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进行有效的转化。等进行有效的转化。先将大肠杆菌培养至先将大肠杆菌培养至OD600=0.51接着用接着用50-100mmolL CaCl2处理制备成感受态细胞处理制备成感受态细胞然后将然后将DNA与感受态细胞混合与感受态细胞混合在冰浴中反应

13、在冰浴中反应20-40min进行进行42热击可增加热击可增加DNA的吸收（的吸收（107个转化子个转化子/ug质粒质粒DNA ）最经典的转化方法是：最经典的转化方法是：由于异源的质粒由于异源的质粒DNA分子能够进入大肠杆菌细胞，所分子能够进入大肠杆菌细胞，所以大肠杆菌摄取以大肠杆菌摄取DNA是非选择性的。是非选择性的。2. PEG介导的转化介导的转化不能自然形成感受态的不能自然形成感受态的G+细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌，细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌，可通过可通过聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，一般用，一般用PEG 6000)的作用实现转化。的作用实现转化。这类细

14、菌必须首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖这类细菌必须首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖层，然后使其维持在等渗的培养基中，在层，然后使其维持在等渗的培养基中，在PEG存在下，质存在下，质粒或噬菌体粒或噬菌体DNA可被高效地导入原生质体。可被高效地导入原生质体。3. 电脉冲法（电脉冲法（电穿孔法电穿孔法 ）在许多细菌和真核系统中，它们既无自然的感受态呈现也在许多细菌和真核系统中，它们既无自然的感受态呈现也不能用上述的方法建立感受态。因此人们发展了一种新的不能用上述的方法建立感受态。因此人们发展了一种新的将 核 酸 分 子 导 入 细 胞 的 方 法 ， 最 突 出 的 是将 核 酸 分 子

15、 导 入 细 胞 的 方 法 ， 最 突 出 的 是 电 穿 孔电 穿 孔(electroporation)法和基因枪法和基因枪(biolistic)转化法转化法。 电穿孔法：电穿孔法：是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子成小孔，使各种大分子(包括包括DNA)能通过这些小孔进入细能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。胞，所以又称电转化。 电场强度、电脉冲的长度和电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度浓度4. 基因枪基因枪(biolistic)转化转化 基因枪转化法首先由基因枪转化法首先由Sanford报道，该方法是将包裹有报道，该方法是

16、将包裹有DNA的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使DNA留在细胞内，留在细胞内，特别是留在细胞器中。特别是留在细胞器中。用这种方法首次成功地将用这种方法首次成功地将DNA导入酵母线粒体并引起线粒体导入酵母线粒体并引起线粒体遗传变化。基因枪转化现在被广泛地应用于植物的转化中遗传变化。基因枪转化现在被广泛地应用于植物的转化中三、建立转化方法的策略三、建立转化方法的策略 1. 被转化对象（转化受体）被转化对象（转化受体）2. 转化转化DNA的构建（目的）的构建（目的）3. 转化方法选择转化方法选择四、转化应用四、转化应用 在转化中，如果转化因在转化中，如果转化因子

17、的两个基因是连锁的，子的两个基因是连锁的，那么它们可以同时被转那么它们可以同时被转化，也称为共转化，连化，也称为共转化，连锁的两个基因距离越近，锁的两个基因距离越近，其共转化频率越高，反其共转化频率越高，反之则低。利用共转化率之则低。利用共转化率和连锁的二基因间的距和连锁的二基因间的距离的反比关系可进行基离的反比关系可进行基因定位的工作。因定位的工作。1. 连锁检测连锁检测2. 遗传图谱的绘制遗传图谱的绘制基因型基因型数目数目trp2his2tyr1+11940+3360+685+418+2600+107+1180trp2+his2+tyr1+（供体）（供体） trp2-his2-tyr1-

18、（受体）的转化类型（受体）的转化类型trp2-his2重组率= 2600+107+3660+418 100% = 34% 11940+1180+ 2600+107+3660+418 trp2-tyr1重组率= 2600+1180+3660+685 100% = 40% 11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重组率= 418+1180+685+107 100% = 13% 11940+3660+418+1180+685+107trp2 his2 tyr1 3413403. 基因中断基因中断4. 插入基因插入基因第二节第二节 接合作用（接合作用（conjugat

19、ion） 接合作用：接合作用：是指在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从是指在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程，也称细菌杂交供体细胞向受体细胞转移的过程，也称细菌杂交 。 一、接合现象的发现与证实一、接合现象的发现与证实 Lederberg和和Tatum（1946年）建立了用大肠杆菌年）建立了用大肠杆菌K12的两个的两个营养缺陷型菌株在基本培养基上是否生长，来检验细菌杂交营养缺陷型菌株在基本培养基上是否生长，来检验细菌杂交或重组存在的方法。在此以前，没有人证实细菌杂交现象。或重组存在的方法。在此以前，没有人证实细菌杂交现象。细菌杂交有别于典型的有性杂交，故称为细

20、菌接合作用。细菌杂交有别于典型的有性杂交，故称为细菌接合作用。A菌株菌株B菌株菌株混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂交的结果？交的结果？必须要排除下列几种解释：必须要排除下列几种解释：一是细菌细胞并没有接合，而是交换了一是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用转化作用)二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料(互养互养)三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变回复突变当时当时Lederberg和和Tatum已经已经证明，当把证明，当把A菌株的培养

21、液菌株的培养液经过灭菌，再加入到经过灭菌，再加入到B菌株菌株的培养液中，没有原养型菌的培养液中，没有原养型菌落，这说明上述实验并非转落，这说明上述实验并非转化的结果。化的结果。1950年，年，Davis通过他的通过他的U形形管 试 验 进 一 步 支 持 了管 试 验 进 一 步 支 持 了Lederberg和和Tatum的结论。的结论。1. 转化作用的排除转化作用的排除营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称为为互养互养。2. 互养的排除互养的排除在在A- B+ T1s和和A+ B- T1r的杂交中，将基因型的杂交中，将基因型A- B+

22、 T1s和和A+ B- T1r两种细菌在基本培养基上混合培养，接触较两种细菌在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间以后，喷上噬菌体短的一段时间以后，喷上噬菌体T1，把，把A- B+ T1s细菌细菌杀死。杀死。经培养以后仍有原养型菌落出现，这说明原养型菌落经培养以后仍有原养型菌落出现，这说明原养型菌落的出现并非由于互养。的出现并非由于互养。 因为大肠杆菌的突变率一般都因为大肠杆菌的突变率一般都10-8，若两个基因同时，若两个基因同时回复突变，则其可能性只有回复突变，则其可能性只有10-16（10-810-8），这），这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出种几率在平板上是很难检测到的

23、，所以混合培养能出现现10-510-6频率的菌落一定是重组的结果。频率的菌落一定是重组的结果。3. 回复突变的排除回复突变的排除4. 遗传物质的单向转移遗传物质的单向转移 正交实验正交实验（A）Strs（B）Strr用链霉素将用链霉素将A菌株杀死菌株杀死重组体的数目变化不大重组体的数目变化不大(A) Strr (B) Strs将将B菌株杀死菌株杀死一个重组体也没有出现一个重组体也没有出现反交实验反交实验（A）met- bio-（Strr或或Strs ）（B）thr- leu- thi-（Strs或或Strr）Hayse（1952）用正反杂交实验证明，细菌重组的发生只）用正反杂交实验证明，细菌重

24、组的发生只是染色体单方向的转移，而且染色体的转移往往不完全。是染色体单方向的转移，而且染色体的转移往往不完全。 把把A菌株认为是菌株认为是供体供体，而，而B菌株是菌株是受体受体A菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进行灭活以菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进行灭活以后，并未影响它传递遗传物质的能力。后，并未影响它传递遗传物质的能力。B菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，必然不能出现重组体。必然不能出现重组体。供体菌株又称为供体菌株又称为雄性细胞雄性细胞，受体菌株又称为，受体菌株又称为雌性细胞雌性细胞StrrA突变型（不育变种）突变型（

25、不育变种） 置冰箱置冰箱1年后供体的年后供体的A菌株菌株Strr B菌株菌株Strs可育的可育的StrsA菌株菌株共培养，一起繁殖共培养，一起繁殖不能得到杂交子不能得到杂交子StrrA菌株菌株 B菌株菌株Strs恢复了恢复了StrrA突变型的可育性突变型的可育性5. F质粒的发现质粒的发现 (Hayes) 大肠杆菌的供体或雄性细胞大肠杆菌的供体或雄性细胞(如如A菌株菌株)记为记为F+，带有一，带有一个性因子或个性因子或致育因子致育因子F (fertility factor)，而另一个不带性，而另一个不带性因子因子F的受体或雌性细胞的受体或雌性细胞(如如B菌株菌株)叫做叫做F-； 杂交杂交F+F

26、-是可育的，杂交是可育的，杂交F-F-是不育的；是不育的； F因子可以传递，从因子可以传递，从F+到到F-细菌，但必须通过细胞接触细菌，但必须通过细胞接触 F因子能够自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从因子能够自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从另一个另一个F+细胞再把它传递过来。细胞再把它传递过来。分析结果：分析结果：F因子是染色体外的一种遗传结构，也就是因子是染色体外的一种遗传结构，也就是质粒质粒(plasmid)。 F+是一种遗传性状是一种遗传性状F 因子的存在使细菌成为因子的存在使细菌成为F+F 因子的丧失使细菌成为因子的丧失使细菌成为F-F+ 细菌分裂仍得到细菌分裂仍得到F+细胞

27、细胞二、二、F F质粒的结构及其在细胞中的存在状态质粒的结构及其在细胞中的存在状态 1. F质粒的遗传结构质粒的遗传结构 F质粒的基因组由三质粒的基因组由三个主要区段组成：转个主要区段组成：转移区、复制区、插入移区、复制区、插入区。区。长度为长度为33 kb，由，由23个基因组成，构成一个个基因组成，构成一个tra操纵子操纵子(tra operon)。tra ABCEFGHKLQUVW与性菌毛的形成有关与性菌毛的形成有关tra YZMIGD等与等与F因子的转移有关因子的转移有关 traG、traN 影响杂交对的配对形成与否影响杂交对的配对形成与否 traI、traM 决定决定DNA转移起始转移

28、起始 traI 编码解旋酶编码解旋酶I(helicase) traD 控制控制DNA转移；转移； traY、traZ 编码的核酸内切酶能在转移起始区编码的核酸内切酶能在转移起始区 oriT上切开一个缺口。上切开一个缺口。（1）转移区）转移区(transfer region)复制区负责复制区负责F质粒的自我复制质粒的自我复制F质粒自主复制区为质粒自主复制区为oriV（Vegetative origin of replication），），在在oriV中包含有复制起点。中包含有复制起点。F质粒的复制是按质粒的复制是按型方式进行复型方式进行复制，它是一种严紧型质粒。制，它是一种严紧型质粒。F质粒的拷

29、贝数能被精确地控制，一个寄主细胞约有质粒的拷贝数能被精确地控制，一个寄主细胞约有12个个F质质粒。粒。rep（F replicative protein）编码一组与编码一组与F质粒复制相关的质粒复制相关的蛋白质。蛋白质。inc（incompatibility）基因产物使细胞具有不相容性。基因产物使细胞具有不相容性。（2）复制区（）复制区（replication region）F质粒插入区包含质粒插入区包含4个插入顺序：个插入顺序：2个个IS31个个IS21个个Tn1000（）它们与它们与F质粒的整合、切除、易位有关质粒的整合、切除、易位有关 （3）插入区（）插入区（insertion regi

30、on）2. F质粒在细胞内的存在形式质粒在细胞内的存在形式 根据大肠杆菌细胞内有无根据大肠杆菌细胞内有无F质粒及质粒及F质粒在细胞内的存在状质粒在细胞内的存在状态可将细胞分为态可将细胞分为4种类型：种类型：F-、F+、Hfr、F。F-：是细胞内不含是细胞内不含F质粒；质粒；F+：是细胞内含有是细胞内含有F质粒且独立染色体外；质粒且独立染色体外；Hfr菌株菌株(high frequency recombination strain)：高频重组高频重组菌株：菌株：是是F质粒整合到宿主的染色体上，随着宿主染色体质粒整合到宿主的染色体上，随着宿主染色体的复制而复制；的复制而复制；F是指携带了宿主的一部

31、分染色体的是指携带了宿主的一部分染色体的F质粒。质粒。 三、三、F质粒与接合作用质粒与接合作用 1. F+F-杂交杂交有有F质粒的细胞在形态学上质粒的细胞在形态学上可以与可以与F-明显区别。除了共明显区别。除了共有的大量表面菌毛以外，有的大量表面菌毛以外，F+还有少量（通常在细胞对数还有少量（通常在细胞对数生长期中只有生长期中只有13根）性菌根）性菌毛。纤细的蛋白质性菌毛有毛。纤细的蛋白质性菌毛有的长数毫米，直径约为的长数毫米，直径约为8nm。性菌毛在细菌的接合过程。性菌毛在细菌的接合过程中起着十分重要的作用。中起着十分重要的作用。 2. HfrF-杂交杂交 Hfr菌株是怎样形成的呢菌株是怎样

32、形成的呢? F质粒有两种方式整合到质粒有两种方式整合到染色体上：同源重组、质染色体上：同源重组、质粒和染色体共有插入序列粒和染色体共有插入序列和转座子。大肠杆菌染色和转座子。大肠杆菌染色体基因组有体基因组有7个个IS1、13个个IS2及及6个个IS3；F质粒有质粒有1个个IS2和和2个个IS3。 3. FF-杂交杂交 F质粒在脱离质粒在脱离Hfr细胞的染色体时也会发生差错，从而形成带有细菌细胞的染色体时也会发生差错，从而形成带有细菌染色体基因的染色体基因的F质粒。而质粒。而F因子又可通过交换融合到细菌染色体的因子又可通过交换融合到细菌染色体的原来位置上，回复到原来的原来位置上，回复到原来的Hf

33、r状态。状态。由于在由于在FF-接合使用接合使用中能专一性地向中能专一性地向F-转移转移F质粒携带的供体基因，质粒携带的供体基因，因而通过因而通过F因子的转移因子的转移而使受体菌改变其遗而使受体菌改变其遗传性状，这种现象也传性状，这种现象也被称为被称为F 因子转导因子转导。四、中断杂交试验和基因定位四、中断杂交试验和基因定位 中断杂交：中断杂交：就是将两个菌株（例如就是将两个菌株（例如Hfr a+ strsF- a strr）在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中断杂交，经过稀释接种液放入组织捣碎器里搅拌以中断杂交

34、，经过稀释接种到鉴别培养基上，待形成菌落后鉴定它们的基因型。到鉴别培养基上，待形成菌落后鉴定它们的基因型。 1957年年Wollman和和Jacob首次进行首次进行中断杂交实验：中断杂交实验：供体菌：供体菌：HfrH strs thr+ leu+ azis tons lac+ gal+受体菌：受体菌： F- strr thr leu- azir tonr lac- gal-0 azi ton lac gal F0 thr lac trp his thy arg str F2 8 27 45 61 69 73Peptide-induced transfer of Enterococcus fae

35、calis plasmid pCF10. (A) Peptide pheromone cCF10 (triangles) is expressed from the chromosome of both plasmid-containing donor cells and plasmid-free recipient cells. Inhibitor peptide (stars) is expressed from pCF10 and secreted into the medium to prevent pheromone from the donor cell from inducing

36、 itself, probably through competitive binding to the pheromone binding protein PrgZ. (B) Pheromone from a nearby recipient cell is detected by PrgZ. PrgZ imports the peptide pheromone using the chromosomally encoded Opp (Oligopeptide permease) system. (C) Imported cCF10 induces expression of transfe

37、r genes, including the cellsurface adhesin PrgB. (D) PrgB mediates aggregation of the donor and recipient cells. A mating channel is then formed and single-stranded pCF10 is transferred to the donor cell via a rolling circle mechanism. After pCF10 has established itself in the recipient cell, the in

38、hibitor peptide and another mechanism of negative control, PrgY, is expressed to prevent self-induction by endogenous cCF10.第三节第三节 转导转导 (transduction) 转导转导：是利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分：是利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移转移到受体菌内的现象。因为绝大多数细菌都有噬菌体，所到受体菌内的现象。因为绝大多数细菌都有噬菌体，所以转导作用较普遍。另外，转导以转导作用较普遍。另外，转导DNA位于噬菌体蛋白外位于噬菌体蛋白外壳内，不易被外

39、界的壳内，不易被外界的DNA水解酶所破坏，所以比较稳定。水解酶所破坏，所以比较稳定。 局限性转导：局限性转导：被转导的被转导的DNA片段仅仅是那些靠近染色片段仅仅是那些靠近染色 体上溶源化位点的基因体上溶源化位点的基因转导转导普遍性转导：普遍性转导：任何供体的染色体都可以转移至受体细胞任何供体的染色体都可以转移至受体细胞1952年年Lederberg和他的学生和他的学生Zinder把鼠伤寒沙门菌把鼠伤寒沙门菌的一个突变菌株的一个突变菌株LT22(trp-)和另一个突变菌株和另一个突变菌株LT2(his-)在基本培养基上进行混合培养，结果在在基本培养基上进行混合培养，结果在107细胞中得到细胞中

40、得到大约大约100个原养型菌落。个原养型菌落。 一、转导现象的发现一、转导现象的发现 LT2菌株菌株LT22菌株菌株中间用滤板隔开中间用滤板隔开U形管实验形管实验 可过滤因子并不由于可过滤因子并不由于DNA酶的处理而失活；酶的处理而失活； 可过滤因子和从溶源性的可过滤因子和从溶源性的LT22菌株得来的噬菌体菌株得来的噬菌体(称为称为 P22)具有相同的大小和质量；具有相同的大小和质量； 可过滤因子加热后失活，用抗可过滤因子加热后失活，用抗P22血清处理后也失活；血清处理后也失活； 把把P22与与 LT2和和LT22菌株分别混合培养，在基本培养基菌株分别混合培养，在基本培养基上不出现原养型菌落。

41、上不出现原养型菌落。结果证实了可过滤因子是温和噬菌体结果证实了可过滤因子是温和噬菌体P22。这就是最早发现。这就是最早发现的的转导现象转导现象。 通过一系列的实验，证实可过滤因子具有下列一些特性：通过一系列的实验，证实可过滤因子具有下列一些特性：转导过程中有三个组成部分，即转导过程中有三个组成部分，即供体、噬菌体和受体供体、噬菌体和受体。这种。这种导致基因重组的方式不同于转化，转化需要供体导致基因重组的方式不同于转化，转化需要供体DNA和受体和受体细胞接触，而转导则是以噬菌体为媒介将供体遗传物质传给细胞接触，而转导则是以噬菌体为媒介将供体遗传物质传给受体，无需受体，无需DNA和受体细胞接触。和

42、受体细胞接触。转导可分为转导可分为普遍性转导和局限性转导普遍性转导和局限性转导，普遍性转导又可分为，普遍性转导又可分为完全转导和流产转导完全转导和流产转导。二、普遍性转导二、普遍性转导1. 完全转导完全转导P1 供体供体 收集子代噬菌体收集子代噬菌体菌苔计数噬菌体菌苔计数噬菌体（完全培养基）（完全培养基）受体受体（缺陷型大肠杆菌）（缺陷型大肠杆菌）选出重组子选出重组子（转导子）（转导子）（基本培养基）（基本培养基）侵染侵染 裂解裂解 侵染侵染野生型野生型转导频率转导频率= 转导子数转导子数 100% = 转导子数转导子数 100% 侵染受体的侵染受体的P1颗粒数颗粒数 噬菌斑数噬菌斑数+转导子

43、数转导子数2. 流产转导流产转导3. 普遍性转导在遗传学和分子生物学研究中的应用普遍性转导在遗传学和分子生物学研究中的应用 (1)共转导：共转导： 普遍性转导的重要应用之一是通过测定共转普遍性转导的重要应用之一是通过测定共转导的频率进行基因定位，所谓导的频率进行基因定位，所谓共转导共转导(cotransduction)是指是指两个处在一个转导片段上的基因一起整合进受体染色体中。两个处在一个转导片段上的基因一起整合进受体染色体中。 被共转导的两个基因之间的距离不能超过转导噬菌体所能被共转导的两个基因之间的距离不能超过转导噬菌体所能包装的包装的DNA长度，而且越是紧密连锁的基因其共转导频率长度，而

44、且越是紧密连锁的基因其共转导频率也越高。也越高。F为共转导频率，为共转导频率，d 为基因间距离，为基因间距离，L为转导片段长度（这为转导片段长度（这里指噬菌体基因组长度，用分钟表示）里指噬菌体基因组长度，用分钟表示）F = (1 d/L)3 d = L (13F)以以thr+leu+为供体，以为供体，以thr-leu-为受体的为受体的P1噬菌体转导实验噬菌体转导实验中，得到中，得到1%的的thr+leu+转导子，计算转导子，计算thr和和leu之间的遗传之间的遗传图距。（图距。（P1噬菌体基因组约为大肠杆菌染色体长度的噬菌体基因组约为大肠杆菌染色体长度的2.4%） d = 2.4 (130.0

45、1) = 2.4 (1-0.215) = 1.883 (2)三点杂交法：三点杂交法：P1噬菌体所进行的共转导被广泛应用于大肠噬菌体所进行的共转导被广泛应用于大肠杆菌的基因定位中。杆菌的基因定位中。1955年年Lennox用用P1噬菌体转导寄主大肠噬菌体转导寄主大肠杆菌染色体，研究基因连锁关系时发现，杆菌染色体，研究基因连锁关系时发现，thr和和leu有时能、有有时能、有时不能与第三个基因时不能与第三个基因ara共转导。共转导。 实验实验选择基因选择基因测定的基因测定的基因 1 ara+75% leu+, 0% thr+ 2 thr+ leu+85% ara+他用他用P1噬菌体感染供体噬菌体感染

46、供体(thr+ leu+ ara+)，用所得到的噬菌，用所得到的噬菌体裂解液去感染受体菌体裂解液去感染受体菌(thr- leu- ara-)，得到的结果。，得到的结果。 实验实验1可知：可知：ara基因与基因与leu基因靠得较近，而与基因靠得较近，而与thr基因相距较基因相距较远，排列顺序应是远，排列顺序应是thr-ara-leu或或thr-leu-ara。如果是前一种情况，则如果是前一种情况，则thr+ leu+转导子应该大多数含有转导子应该大多数含有ara+基基因因；如果是后一种形式，则；如果是后一种形式，则thr+ leu+转导子应该很少含有是转导子应该很少含有是ara+，或者根本没有。

47、，或者根本没有。而由实验而由实验2可知，可知，thr+ leu+转导子同时又是转导子同时又是ara+的占的占85，所以，所以上述上述3个基因的排列顺序是第个基因的排列顺序是第1种。种。三、局限性转导三、局限性转导(specialized transduction) 局限性转导：局限性转导：是指以噬菌体为媒介，只能将供体菌特定的是指以噬菌体为媒介，只能将供体菌特定的一个或几个一个或几个基因基因转移到受体菌中的转导现象。转移到受体菌中的转导现象。导致局限性转导的一般都是温和噬菌体，它们在供体菌染导致局限性转导的一般都是温和噬菌体，它们在供体菌染色体上具有特定的整合位点。在某些条件下，当这种整合色体

48、上具有特定的整合位点。在某些条件下，当这种整合状的原噬状的原噬菌菌体脱离寄主染色体时，偶尔会将整合位点两端体脱离寄主染色体时，偶尔会将整合位点两端相邻的相邻的基因基因错误地切离下来，并组装到噬菌体颗粒中。当错误地切离下来，并组装到噬菌体颗粒中。当这种噬菌体感染另一细菌时，就将原寄主的这种噬菌体感染另一细菌时，就将原寄主的基因基因转移到另转移到另一细菌中。一细菌中。1高频转导的原理高频转导的原理不正常环出形成不正常环出形成特殊性转导颗粒特殊性转导颗粒这种缺陷噬这种缺陷噬菌体菌体亦是转导噬亦是转导噬菌体，菌体，它具有感染能力，能整它具有感染能力，能整合到寄主染色体相同的位点上形成稳定的转导子。合到

49、寄主染色体相同的位点上形成稳定的转导子。所得转导子的频率约所得转导子的频率约为为10-6，称为低频转导。，称为低频转导。当携当携带带有有gal基因的基因的缺陷噬菌体和正常的缺陷噬菌体和正常的噬菌体噬菌体在同一细胞时，正常在同一细胞时，正常噬菌体整合到噬菌体整合到寄主寄主的染色体的染色体上后，上后，产产生生两个杂合两个杂合(细菌细菌/噬噬菌体菌体)att位点，位点，dgal缺陷噬菌体就可以整合到该位点上。缺陷噬菌体就可以整合到该位点上。高频转导高频转导子的形成子的形成杂基因子杂基因子重组性转导重组性转导再次整合导致再次整合导致溶源性转导溶源性转导正正常常噬菌体噬菌体帮帮助助dgal缺陷噬菌体整合

50、和繁殖，因此被缺陷噬菌体整合和繁殖，因此被称为称为助手噬菌体（助手噬菌体（helper phage）。这种转导子不稳定，。这种转导子不稳定，因为原噬菌体很容易被诱导切离下来。因为原噬菌体很容易被诱导切离下来。在这种切离的裂解物中，有一半是正常在这种切离的裂解物中，有一半是正常噬菌体，另一噬菌体，另一半为半为dgal缺陷噬菌体。如果用这种裂解物去转导另一个缺陷噬菌体。如果用这种裂解物去转导另一个Gal-菌株，其转化频率理论上可达菌株，其转化频率理论上可达50%，所以也称之为，所以也称之为高频转导高频转导。CRISPR结构及作用机理结构及作用机理nCRISPR (Clustered regular

51、ly interspaced short palindromic repeat)为规律成簇间隔短回文重为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古复，是一类广泛分布于细菌和古菌 基 因 组 中 的 重 复 结 构菌 基 因 组 中 的 重 复 结 构 。CRISPR通过与一系列相关蛋白通过与一系列相关蛋白、前导序列一起，为原核生物提、前导序列一起，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力性免疫能力。 这种结构最早于这种结构最早于19871987年在大肠杆菌年在大肠杆菌(Escherichia coli) K12的的iap基因侧翼序列中被发现，后来，科

52、学家利用这个小片段基因侧翼序列中被发现，后来，科学家利用这个小片段找到了一种操作简单、可对多种生物的基因组进行遗传改造找到了一种操作简单、可对多种生物的基因组进行遗传改造的工具的工具CRISPRCas系统。系统。 后续的遗传学试验和生物化学试验也证实，这些后续的遗传学试验和生物化学试验也证实，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，很序列是互补的，很有可能是生物体抵御病毒等外来人侵者的一套特异性防御机有可能是生物体抵御病毒等外来人侵者的一套特异性防御机制，就像是另外一套适应性免疫反应系统。制，就像是另外一套适应性免疫反应系统。CRISPR系统基本结构

53、系统基本结构n CRISPR系统由前导序列（系统由前导序列（leader sequence，LS）、）、 CRISPR基因座以及一系列基因座以及一系列Cas （CRISPR-associated）蛋）蛋白组成。白组成。nLeader序列序列： Leader序列前导序列由序列前导序列由300500bp碱基组成，位于碱基组成，位于CRISPR的的5端，与第一个重复序列直接相连，是一段在物种内相对保端，与第一个重复序列直接相连，是一段在物种内相对保守的守的AT富集的区域。有研究表明前导序列是新插入序列的识别位点，富集的区域。有研究表明前导序列是新插入序列的识别位点，也有研究指出，它能够作为启动子，启

54、动也有研究指出，它能够作为启动子，启动CRISPR基因座的转录基因座的转录。nCRISPR基因座基因座：CRISPR基因座由简短稳定的同向重复基因座由简短稳定的同向重复序列序列(direct repect，DR)和长度相近的非重复的间隔序列和长度相近的非重复的间隔序列(spacer)间隔排列而成，称为间隔排列而成，称为R-S结构。其中重复序列的片结构。其中重复序列的片段长度在段长度在2148b，且含有，且含有57 bp的回文序列，通常能形的回文序列，通常能形成稳定的茎环结构，间隔序列的长度在成稳定的茎环结构，间隔序列的长度在2672 bp，可能，可能来源于噬菌体、质粒等外源来源于噬菌体、质粒等

55、外源DNA序列。序列。Cas基因：基因：cas基因是存在于基因是存在于CRISPR位点附近的一系列基因，位点附近的一系列基因，cas基因基因簇通常由簇通常由410个保守基因组成，它表达出的个保守基因组成，它表达出的cas蛋白对蛋白对CRISPR防御防御机制的实现不可或缺。机制的实现不可或缺。cas基因根据其保守程度可分为核心基因根据其保守程度可分为核心cas基因、基因、亚型特异性亚型特异性cas基因和重复序列相关未知蛋白基因和重复序列相关未知蛋白(repeatassociated mysterious proteins，RAMP)组件基因。组件基因。 cas16基因广泛存在于各种基因广泛存在于各种CRISPR亚型中，故被称为核心亚型中，故被称为核心cas基因，其编码蛋白的功能现已初步得到证实，例如，基因，其编码蛋白的功能现已初步得到证实，例如，Casl和和Cas2蛋白蛋白在