肿瘤细胞与分化、凋亡三_第1页
肿瘤细胞与分化、凋亡三_第2页
肿瘤细胞与分化、凋亡三_第3页
肿瘤细胞与分化、凋亡三_第4页
肿瘤细胞与分化、凋亡三_第5页
已阅读5页,还剩33页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义1胚胎发育和形态发生胚胎发育和形态发生2细胞稳态和免疫机制细胞稳态和免疫机制3衰老衰老4肿瘤发生及化学治疗肿瘤发生及化学治疗 细胞凋亡和恶性肿瘤细胞凋亡和恶性肿瘤 1 bcl2和恶性肿瘤和恶性肿瘤 2 p53和恶性肿瘤和恶性肿瘤 3bcr-abl和恶性肿瘤和恶性肿瘤 4 pml-rar蛋白和恶性肿瘤蛋白和恶性肿瘤细胞凋亡干预和肿瘤治疗细胞凋亡干预和肿瘤治疗 1 野生型野生型p53基因介导的肿瘤治疗基因介导的肿瘤治疗 2 bcl2基因介导的肿瘤治疗基因介导的肿瘤治疗 3 泛素蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗泛素蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗 4 三氧化二砷介

2、导的血液系统恶性肿瘤治疗三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗 5 dads诱导肿瘤细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡的检测方法1 台肦蓝(台肦蓝(trypan blue)染色法染色法 原理:原理:trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料。坏死是一种细胞膜非通透性染料。坏死细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色。因此,该法能细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色。因此,该法能区分细胞的生存状态,简单、便捷、常规用于细胞死亡区分细胞的生存状态,简单、便捷、常规用于细胞死亡的初步评价和细胞存活率评价。的初步评价和细胞存活率评价。 注意事项:该法不能区别继发性坏死和真正意义上的注意事项:该法不能区别继发

3、性坏死和真正意义上的坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度。(因为早期凋亡坏死细胞;也容易低估细胞死亡程度。(因为早期凋亡细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞)细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞)荧光显微镜观察荧光显微镜观察 图图9a 9a 未处理的未处理的hl-60hl-60细胞细胞 图图9b dads9b dads处理的处理的hl-60hl-60细胞细胞 吖啶橙吖啶橙 40 40 吖啶橙吖啶橙 40403 电子显微镜观察法电子显微镜观察法 电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特点,如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失、染色质固缩和线粒体超浓缩等,但由于样本制备复杂、耗时,该项技术主要用于获取细

4、胞凋亡的定性检测。3 3 透射电镜观察透射电镜观察 图图8a 8a 未处理的未处理的hl-60hl-60细胞细胞 图图8b dads8b dads处理的处理的hl-60hl-60细胞细胞 透射电镜透射电镜6000 6000 透射电镜透射电镜600060004 dna断片法或称琼脂糖凝胶电泳断片法或称琼脂糖凝胶电泳“梯形条带梯形条带”图谱法图谱法 原理:凋亡细胞的基因组dna常首先被剪切为200-300kb和30-50kb的片断(“结构域式”剪切),再进一步降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体片断(“裂解”/“梯子式”剪切)。因此,在琼脂糖凝胶电泳图谱上凋亡细胞表现为特

5、征性“梯子”样外观。 注意事项:梯状dna(dna ladder)现象常被看作是细胞凋亡的重要生物化学标志。但是,日益增多的资料显示并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子样外观。因此,缺乏梯状dna并不能排除细胞凋亡的存在。据报道,某些细胞系如k562细胞凋亡常发生单链而不是双链dna降解,故不能形成“dna ladder”。另外,一般凋亡率要在15%以上才能呈现典型“dna ladder” 。故有dna ladder可以肯定凋亡存在,没有dna ladder不能排除凋亡的存在。 .tunel法(末端法(末端dna转移酶转移酶dutp缺口末端标记法)缺口末端标记法) 原理:原理:d

6、na聚合酶能够填补双链聚合酶能够填补双链dna中的单链缺中的单链缺 失部失部分,应用放射性同位素、生物素和荧光素等标记的三磷酸核分,应用放射性同位素、生物素和荧光素等标记的三磷酸核苷酸形成新的苷酸形成新的dna。 tunel法是在含标记法是在含标记dutp的反应体系的反应体系中,加以末端中,加以末端dna转移酶。故又称为转移酶。故又称为tdt(terminal deoxy-transferase)法。该法是应用无需模板的法。该法是应用无需模板的dna聚合酶,延伸聚合酶,延伸核苷酸的碱基序列与核苷酸的碱基序列与dna底物无关。底物无关。 注意事项:该法只能了解注意事项:该法只能了解dna是否断裂

7、和发生是否断裂和发生dna断裂断裂的细胞数量,虽然在理论上对这种方法的特异性尚有争议,的细胞数量,虽然在理论上对这种方法的特异性尚有争议,但操作简便,并且可大量应用于回顾性研究,从而成为目前但操作简便,并且可大量应用于回顾性研究,从而成为目前较为流行的细胞凋亡评价方法。较为流行的细胞凋亡评价方法。tuneltunel检测结果检测结果 图图10a 10a 未处理的未处理的hl-60hl-60细胞细胞 图图10b dads10b dads处理的处理的hl-60hl-60细胞细胞 tunel tunel 20 tunel 20 tunel 20206 pi染色流式细胞术测定凋亡率染色流式细胞术测定凋

8、亡率 原理:实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分原理:实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分子量子量dna 外漏,导致细胞内外漏,导致细胞内dna含量减少。因此,应用含量减少。因此,应用dna特异荧光染料(如碘化丙啶,特异荧光染料(如碘化丙啶,propidium iodide, pi)染色后,)染色后,在在fcm进行的细胞周期分析中,凋亡细胞常以亚二聚体形式出进行的细胞周期分析中,凋亡细胞常以亚二聚体形式出现。亚二倍体细胞群被称为亚现。亚二倍体细胞群被称为亚g1期(期(sub-g1)细胞。它的出现细胞。它的出现被认为是凋亡细胞的重要标志。被认为是凋亡细胞的重要标志。 注意事项:识

9、别亚注意事项:识别亚g1期细胞的同时,必须将它和细胞碎期细胞的同时,必须将它和细胞碎片区分开来,因为细胞碎片的片区分开来,因为细胞碎片的dna含量也明显低于含量也明显低于g1期细胞。期细胞。2.3 2.3 流式细胞仪检测凋亡率流式细胞仪检测凋亡率 control 5mgl-1dads 7.5mgl-1dads 10mgl-1dads 15mgl-1dads 20mgl-1dads 10mgl-1dads+pd 10mgl-1dads+sb3.3 3.3 流式细胞仪检测凋亡率流式细胞仪检测凋亡率 fig15 effects of sb205980 and pd98059 on dads -ind

10、ucedapoptosis in hl-60 cells05101520253035untreatedpdsbdads5dads10dads10+pd dads10+sbapoptotic cells(%)细胞凋亡死亡受体相关信号途径 细胞凋亡死亡受体相关信号途径 表表3 caspase 家族主要成员家族主要成员序号序号 原名原名 功能功能 底物特异性底物特异性caspase-1 ice 辅助炎症辅助炎症 wehdcaspase-2 ich-1 凋亡反应凋亡反应 dexdcaspase-3 cpp32,yama,apopain 凋亡反应凋亡反应 dexdcaspase-4 icerel-,tx

11、,ich-2 辅助促炎症辅助促炎症 wehdcaspase-5 icerel-,ty 辅助促炎症辅助促炎症 wehdcaspase-6 mch-3 凋亡反应凋亡反应 (i/l/v)exdcaspase-7 mch-3,ice-lap3,cmh-1 凋亡反应凋亡反应 dexdcaspase-8 flice,mach,mch-5 凋亡反应凋亡反应 (i/l/v)exdcaspase-9 ice-lap6.mch6 凋亡反应凋亡反应 (i/l/v)exdcaspase-10 mch4 凋亡反应凋亡反应caspase-11 ich-3caspase-12 caspase-13 erichcaspase

12、-14 mice(mini-ice)pro-caspase3pro-caspase9cyt-cgapdhhl-60time(h) 0 1 2 4 8 24图图30 dads作用作用hl-60细胞后细胞后caspase3的表达变化的表达变化pro-caspase3pro-caspase9cyt-cgapdhk562time(h) 0 1 2 4 8 24图图31 dads作用作用k562细胞后细胞后caspase3的表达变化的表达变化pro-caspase3pro-caspase9cyt-cgapdhrajitime(h) 0 1 2 4 8 24图图32 dads作用作用raji细胞后细胞后c

13、aspase3的表达变化的表达变化细胞凋亡线粒体相关信号途径细胞凋亡线粒体相关信号途径mmp开放开放线粒体外膜pbrcyclophilin dantporinm 下降aif cyto c/apaf-1/procaspase-9 caspase-9-caspase-8 caspase-3 apoptosis baxmitotracker overlay图图3434激光共聚焦检测激光共聚焦检测hl-60细胞中细胞中bax的线粒体转位的线粒体转位overlaymitotrackerbax图图3535激光共聚焦检测激光共聚焦检测k562k562细胞中细胞中bax的线粒体转位的线粒体转位dads通过启动

14、mcl-1/bid/bax/caspase-9/caspase-3线粒体凋亡通路诱导hl-60和k562细胞凋亡。mmp开放和caspase活化的“正反馈”环mmp开放caspase-3活化线粒体膜屏障功能破坏线粒体肿胀cyoto c释放apoptosome(procaspase-9/apaf-1/cyto c)caspase-9活化膜间蛋白(如aif)释放刺激ceremide酶活化 剪切mmp复合物凋亡诱导剂凋亡诱导剂结 合结 合 a p a f - 1 和和procaspase-9内源性细胞凋亡抑制物 1 caspase8(flice)抑制蛋白(抑制蛋白(flip) 2 sodd(sile

15、ncer of death domain) 3 iap(inhibitor of apoptosis protein) 4 survivin 5 bcl-2家族蛋白家族蛋白bcl2家族蛋白的结构和功能家族蛋白的结构和功能 bcl2的两大结构域:的两大结构域: tm bhbcl2家族蛋白活性调节家族蛋白活性调节 bcl2 家族蛋白的效应机制家族蛋白的效应机制mcl1bcl-2bidbaxbakgapdhhl-60time(h) 0 1 2 4 8 24图图24 dads处理处理hl-60细胞后细胞后bcl-2家族成员的表达变化家族成员的表达变化gapdhbakbaxbcl-2k562bidtim

16、e(h) 0 1 2 4 8 24图图25 dads作用作用k562细胞后细胞后bcl-2家族成员的表达变化家族成员的表达变化mcl1time(h) 0 1 2 4 8 24mcl1bcl-2bidbaxbakgapdhraji图图26 dads作用作用raji细胞后细胞后bcl-2家族成员的表达变化家族成员的表达变化quantitation data for cycling b.fam/sybrstandard curvequantitation data for cycling b.fam/sybrstandard curvestandard curvequantitation data for cycling b.fam/sybr 总总 结结 诱导恶性肿瘤细胞分化与凋亡是当前肿瘤研究领域中诱导恶性肿瘤细胞分化与凋亡是当前肿瘤研究领域中的热门课

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论