第04章蛋白质的分离纯化和表征

1、第第 四四 章章一一 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液phph条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pi) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一ph时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的ph称为称为蛋白质的等电

2、点。蛋白质的等电点。 *蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 二二 蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状 三三 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (一一)胶体性质胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质

3、带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（二）蛋白质的沉淀（二）蛋白质的沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 沉淀方法沉淀方法*盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠

4、或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。 *有机溶剂深沉法有机溶剂深沉法 如乙醇如乙醇,丙酮等沉淀。丙酮等沉淀。 *重金属盐沉淀法析重金属盐沉淀法析 金属离子金属离子 *生物碱试剂和某些酸类沉淀法析生物碱试剂和某些酸类沉淀法析 生物碱生物碱 *加热变性沉淀法析加热变性沉淀法析 加热加热 四四 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则 五五 蛋白质分离纯化的方法蛋白质分离纯化的方法 1 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝

5、胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技术。术。2 层析层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相

6、中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* * 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利利用用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。目目 录录目目 录录3 超速离心超速离心* * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient, s)表示表示,沉降系沉降系数与蛋白质的密度和形状相关数与蛋白质的密度和形状相关 。因为沉降系数因为沉降系数s大体上和分子量成正比大