第12章微生物的分类鉴定

1、微生物的微生物的分类和鉴定分类和鉴定形成于形成于35亿年前的微生物化石亿年前的微生物化石主要是些类似简单杆状细菌的原始生物主要是些类似简单杆状细菌的原始生物形成于形成于8.5亿年前的微生物化石亿年前的微生物化石20亿年前以后的岩石中的微生物的化石形态多样性明显增多亿年前以后的岩石中的微生物的化石形态多样性明显增多形成于形成于10亿年前的微生物化石亿年前的微生物化石形态上非常类似于形态上非常类似于现代的蓝细菌，现代的蓝细菌，进行不产氧光合作用的光能自养进行不产氧光合作用的光能自养菌，及菌，及化能无机营养的硫细菌。化能无机营养的硫细菌。形态上类似于形态上类似于现代的绿藻（真核生物）现代的绿藻（真核

2、生物）今天仍生存在地球上的生物种类，今天仍生存在地球上的生物种类，彼此之间都有或远或近的历史渊源。彼此之间都有或远或近的历史渊源。最原始的生命最原始的生命漫长的进化历程漫长的进化历程千姿百态的生物种类千姿百态的生物种类生物分类的二种基本原则生物分类的二种基本原则：a）根据表型）根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种特征的相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关系为目标；物亲缘关系为目标；b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物

3、之间的进化关系，建立反映生物系是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统。统发育的分类系统。从进化论诞生以来，已经成为生物学家普遍接受的分类原则从进化论诞生以来，已经成为生物学家普遍接受的分类原则生物系统学生物系统学(systematics(systematics) )进化的测量指征进化的测量指征rrna作为进化指征作为进化指征 生物功能：生物功能：rrna参与蛋白质的合成。参与蛋白质的合成。 分子结构：序列中既存在高度保守的区域，也存在高度变化分子结构：序列中既存在高度保守的区域，也存在高度变化区域。其中区域。其中16s rrna大小适合，操作方便。大小适合，操作方便。

4、数量与分布：数量大，普遍存在于原核和真核生物中。数量与分布：数量大，普遍存在于原核和真核生物中。利用利用16s rdna序列对微生物进行鉴定序列对微生物进行鉴定利用利用16srrna建立分子进化树的美国科学家建立分子进化树的美国科学家 carl woese 微生物的微生物的16sr dna序列具有进化上的序列具有进化上的保守性，因此可作为分类的良好依据。保守性，因此可作为分类的良好依据。基于基于16s rdna序列序列同源性的脱氮细菌系同源性的脱氮细菌系统发育树统发育树 培养微生物培养微生物提取基因组提取基因组dnarrna序列测定序列测定分析比较分析比较微生物之间的系统发育关系微生物之间的系

5、统发育关系16s rdna微生物鉴定流程微生物鉴定流程pcr扩增扩增16s rdna片段片段第一节第一节 细菌分类细菌分类分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。分类分类(classification)：根据一定的原则：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育表型特征相似性或系统发育相关性相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的

6、系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定；微生物进行鉴定；(根据现有数据建立系统的过程根据现有数据建立系统的过程)分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：鉴定鉴定分类、分类、命名、命名、命名命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；的名称；(分类系统建立过程中的步骤之一分类系统建立过程中的步骤之一)鉴定鉴定(identification或或determination)：借助于现有的微生物分类借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、

7、或新发现的、或未明确分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。地位的微生物所应归属分类群的过程。(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程)主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识常用的细菌分类学术语：常用的细菌分类学术语：1）培养物）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长 物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。2）菌株）菌株(strain

8、)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养 物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变如通过诱变) 所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株， 以便与原来的菌株相区别。以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体一、分类单元及其等级一、分类单元及其等级bacillus subtilisasi.398bacillus subtilisbf7658生产蛋白酶生产蛋白酶生产生产淀粉

9、酶淀粉酶3）型）型(form或或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等。不同分为不同的噬菌型等。4）种（）种（species）：）： 物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。高等生物中，高等生物中，“生殖隔离生殖隔离”被看作是区分物种的标准。被看作是区

10、分物种的标准。微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有很明显的区别。他类群的菌株有很明显的区别。伯杰氏手册伯杰氏手册伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册(bergeys manual of determinative bacteriology)美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(d.bergey)(1860-1937) 1957年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌分类学家参加编写际上细菌分类学家参加编写(如如1974年第八版，撰稿

11、年第八版，撰稿人多达人多达130多位，涉及多位，涉及15个国家；现行版本撰稿人多个国家；现行版本撰稿人多达达300多人，涉及近多人，涉及近20个国家个国家)，所以它的近代版本反所以它的近代版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册(bergeys manual of systematic bacteriology)伯杰氏手册伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特点是描述非常详

12、细，包括对细菌各个属依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。（20世纪世纪80年代末期）年代末期）二、微生物的命名二、微生物的命名双名法，属名和种名加词组成，一般用斜体表示。双名法，属名和种名加词组成，一般用斜体表示。属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp来表示，来表示，例如例如 baci

13、llus sppseudomonas aeruginosa 铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌二、微生物的命名二、微生物的命名由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，细菌系统分类也像其他生物分类一样采用细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念模式概念”种和亚种指定模式菌株（种和亚种指定模式菌株（type strain）；）；亚属和属指定模式种（亚属和属指定模式种（type species）；）；属以上至目级分类单元指定模式属（属以上至目级分类单

14、元指定模式属（type genus）；）；模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。第二节、细菌分类鉴定的特征和技术第二节、细菌分类鉴定的特征和技术在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。形态学特征、形态学特征、生理学特征、生理学特征、生态学特征生态学特征从不同层次从不同层次(细胞的、分子的细胞的、分子的)，用不同学科，用不同学科(化学、物理学、化学、物理学、遗传学、免疫学、分子

15、生物学等遗传学、免疫学、分子生物学等)的技术方法来研究和比较的技术方法来研究和比较不同微生物的不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反，从中发现的反映映微生物类群特征微生物类群特征的资料。的资料。生物分类的传统指标：生物分类的传统指标：一、形态学特征一、形态学特征培养特征、培养特征、运动性、运动性、特殊的细胞结构、特殊的细胞结构、细胞形态及其染色特性、细胞形态及其染色特性、等等等等微生物分类和鉴定的重要依据之一：微生物分类和鉴定的重要依据之一：a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 形态结构的细菌；形态结构的

16、细菌；b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对 的稳定性；的稳定性；二、生理生化特征二、生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；代谢产物等代谢产物等营养类型；营养类型；与氧的关系；与氧的关系；对温度的适应性；对温度的适应性；对对ph的适应性；的适应性；对渗透压的适应性；对渗透压的适应性；酶及蛋白质都是基因产物；酶及蛋白质都是基因产物；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；测定生理生化特征比直接分析基因组要容易

17、得多；测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；二、生理生化特征二、生理生化特征在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标三、核酸的碱基组成和分子杂交三、核酸的碱基组成和分子杂交特点：特点：与形态及生理生化特性的比较不同，对与形态及生理生化特性的比较不同，对dna的碱基的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基

18、因组的差异，因此结果更加可信。生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。1. dna的碱基组成的碱基组成(g+cmol%)dna碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用分类学上，用g+c占全部碱基的克分子百分数占全部碱基的克分子百分数(g+cmol%)来表示各类生物的来表示各类生物的dna碱基因组成特征。碱基因组成特征。1）每个生物种都有特定的）每个生物种都有特定的gc%范围，因此后者范围，因此后者 可以作为分类鉴定的指标。细菌的可以作为分类鉴定的指标。细菌的g

19、c%范围范围 为为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细，变化范围最大，因此更适合于细 菌的分类鉴定。菌的分类鉴定。2）gc%测定主要用于对表型特征难区分的细菌测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性， 从分子水平上判断物种的亲缘关系。从分子水平上判断物种的亲缘关系。3）使用原则：）使用原则：g+c含量的比较主要用于分类鉴定中的含量的比较主要用于分类鉴定中的否定否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的它们应该具有相似的g+c含量，若不同生物

20、之间含量，若不同生物之间g+c含含量差别大表明它们关系远。量差别大表明它们关系远。但具有相似但具有相似g+c含量的生物并不一定表明它们含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。之间具有近的亲缘关系。80年代以前螺菌属年代以前螺菌属(spirillum)不同种的不同种的g+c含量范围宽达含量范围宽达3866%，后来后来“伯杰氏手册伯杰氏手册”(1984)结合其他特征已将其分成三个属：螺菌属、结合其他特征已将其分成三个属：螺菌属、海洋螺菌属海洋螺菌属(oceanospirillum)和水螺菌属和水螺菌属(aquaspirillum) 它们它们g+c含量分别为含量分别为38%、4251%和和4

21、966%；过去根据形态学特征曾认为微球菌属过去根据形态学特征曾认为微球菌属(micrococcus)和葡萄球菌属和葡萄球菌属(staphylococcus)是关系很近的两个属，因而长期放在一个科内，是关系很近的两个属，因而长期放在一个科内，由于由于g+c含量的差异含量的差异(分别为分别为3038%和和6475%)表明它们亲缘关表明它们亲缘关系相当远，现在根据系相当远，现在根据16srrna序列资料已进行新的调整。序列资料已进行新的调整。2. 核酸的分子杂交核酸的分子杂交不同生物不同生物dna碱基排列顺序的异同直接反映生物之间碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。的亲缘关系就越近，反之亦然。t 直接分析比较直接分析比较dna的碱基排列顺序的碱基排列顺序-由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；t 核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物间接比较不同微生物dna碱基排列顺序的相似性碱基排列顺序的相似性特异性的探针主要用于特异性的探针主要用于病原微生物的快速鉴定病原微生物的快速鉴定四、其它四、其它血清学试验、噬菌体分型、生态特性、