姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κBP65核转位的实验研究

1、www.CRTER.org王健，等. 姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子B P65核转位的实验研究姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子B P65核转位的实验研究王 健，马 捷，顾剑华，王富勇，尚修帅，王兆飞，王 祥，陶海荣(上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海市 201900)引用本文：王健，马捷，顾剑华，王富勇，尚修帅，王兆飞，王祥，陶海荣. 姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子B P65核转位的实验研究J.中国组织工程研究，2016，20(15):2163-2170.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.005

2、 ORCID: 0000-0002-4264-8337(王健)文章快速阅读：分析姜黄素防止骨关节炎中软骨损伤的作用机制王健，男，1990年生，安徽省安庆市人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事骨关节炎的基础研究。通讯作者：陶海荣，博士，副主任医师，硕士生导师，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市 201900 并列通讯作者：王祥，博士，副主任医师，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市 201900 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)15-02163-08稿件接受：2016-02-04http:/WWW.SD

3、大鼠 30 只随机为分组：假手术组15只和模型组15只检测指标：(1)姜黄素对骨关节炎软骨细胞核因子B P65 核转位的影响。(2)姜黄素对骨关节炎软骨细胞型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响。(1)模型组建立大鼠创伤性骨关节炎模型并做阳性对照组。(2)假手术组只切开关节腔假手术做阴性对照组。分离软骨细胞进行体外培养：阴性对照组：正常的关节软骨细胞；阳性对照组：成功造模后的关节软骨细胞；姜黄素组：骨关节炎软骨细胞加入姜黄素；PDTC组：骨关节炎软骨细胞加入PDTC。骨关节炎模型鉴定 骨关节炎模型组 正常组织组文题释义：姜黄素：是从姜科、天南星科中的一些植物根茎中提取的一种化学

4、成分，分子式为C21H20O6，为二酮类化合物。核因子Bp65的核转位：核因子B是一种在细胞浆中广泛表达的转录因子，p65-p50二聚体是其主要的存在形式。当细胞处于静息状态时，核因子B通过与抑制性蛋白IB结合，从而以无活性的形式存在于细胞质中。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子产生的第2信使信号导致IB的磷酸化和泛素化，继而被降解，核因子B 脱离了IB的阻滞，可转位至细胞核，p65的核转位是核因子B信号转导通路活化的重要标志。摘要背景：骨关节炎软骨细胞的退化是由于一系列的机械因素、炎性递质、生化因素，尤其是基质金属蛋白酶和活性氧等共同作用导致的。姜黄素在体外已被证明是一

5、种有效地活性氧清除剂和活性氮提供剂，但保护关节软骨抑制骨关节炎作用和机制尚不明确。目的：分析姜黄素防止骨关节炎中软骨损伤的作用机制。方法：SD大鼠 30 只随机分为假手术组15只和模型组15只。模型组建立大鼠创伤性骨关节炎模型(阳性对照组)，分离软骨细胞进行体外培养，使用姜黄素(姜黄素组)和特异性的核因子B抑制剂(PDTC组)共培养软骨细胞 24 h，Western Blotting和免疫荧光检测核因子B P65核内外表达情况。RT-qPCR 检测细胞型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达。 3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083结果与结

6、论：Western Blotting检测显示阳性对照组P65主要在细胞核中表达，细胞浆中表达较少；姜黄素组P65主要在细胞浆中表达，细胞核中表达较少。免疫荧光观察阳性对照组核因子B 均有不同程度的核转位，核转位细胞的核因子B P65荧光标记主要浓集于核区；阴性对照组、姜黄素组和PDTC组核转位细胞的核因子B P65荧光标记主要浓集于胞质区。实时荧光定量RT-qPCR检测显示姜黄素组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达显著低于阳性对照组，而型胶原的表达显著高于阳性对照组。结果说明，姜黄素能够通过抑制骨关节炎模型中软骨细胞核因子B信号通路活化，抑制核因子B P65核转位，抑制软骨细胞释放基质

7、金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达，增加型胶原的含量，保护软骨细胞，延缓软骨退变。关键词：组织构建；软骨组织工程；姜黄素；骨关节炎；NF-B；基质金属蛋白酶；型胶原主题词：姜黄素；骨关节炎；NF-B；基质金属蛋白酶类；型胶原；组织工程基金资助：上海市宝山区科学技术发展基金项目(13-E-5)；上海交通大学“医工交叉”合作基金(YG2014MS23)Curcumin inhibits nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 in a rat model of traumatic osteoarthritisWang Jian,

8、Ma Jie, Gu Jian-hua, Wang Fu-yong, Shang Xiu-shuai, Wang Zhao-fei, Wang Xiang, Tao Hai-rong (Department of Orthopedics, Shanghai Ninth Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, China)AbstractBACKGROUND: Mechanical, inflammatory, and biochemical factors, par

9、ticularly matrix metalloproteinases and reactive oxygen lead to chondrocyte degeneration in osteoarthritis. Curcumin has been shown to be a potent antioxidant; however, its protective effects against chondrocyte degeneration in osteoarthritis remain unclear.OBJECTIVE: To investigate the potential mo

10、lecular mechanisms underlying the protective effects of curcumin on articular cartilage of osteoarthritis in rats. METHODS: A total of 30 Sprague-Dawley rats were used and randomly divided into model group (positive control, n=15) and normal group (negative control, n=15). Rat models of traumatic os

11、teoarthritis were established, and then cartilage cells were isolated from articular cartilage and cultured in vitro. Chondrocytes were treated with curcumin (curcumin group) or PDTC (an inhibitor of nuclear factor-kappa B) for 24 hours. The expression level of nuclear factor-kappa B P65 in nucleus

12、and cytoplasm in chondrocytes were determined by western blot assay and immunofluorescence. Moreover, mRNA expressions of type II collagen, matrix metalloproteinase-1 and -13 were analyzed using RT-qPCR. Wang Jian, Studying for masters degree, Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People's H

13、ospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, ChinaCorresponding author: Tao Hai-rong, M.D., Masters supervisor, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900

14、, China;Corresponding author: Wang Xiang, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, ChinaRESULTS AND CONCLUSION: Nuclear factor-kappa B P65 protein was mainly expressed in nucle

15、us, but few in cytoplasm in positive control group; the reversed results were found in the curcumin group. Nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 was observed mainly in nucleus in the positive control group; however, that was observed mainly in cytoplasm in the negative control, curcumi

16、n, and PDTC groups. Matrix metalloproteinase-1 and -13 mRNA expressions were significantly decreased, while type II collagen mRNA expression was significantly increased in the curcumin group compared with the positive control group. These findings indicated that curcumin protect chondrocytes against

17、 degeneration through inhibiting the activation of nuclear factor-kappa B signaling pathway, suppressing nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 and inhibiting the expressions of matrix metalloproteinase-1 and -13, which are responsible for upregulation of type II collagen expression.Sub

18、ject headings: Curcumin; Osteoarthritis; NF-kappa B; Matrix Metalloproteinases; Collagen Type II; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology of Development Program of Baoshan District, Shanghai, China, No, 13-E-5; the Medical-Engineering Cross Foundation of Shanghai Jiao Tong University,

19、China, No. YG2014MS23Cite this article: Wang J, Ma J, Gu JH, Wang FY, Shang XS, Wang ZF, Wang X, Tao HR. Curcumin inhibits nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 in a rat model of traumatic osteoarthritis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(15):2163-2170.2167ISSN 2095-4344 CN 21-1

20、581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨关节炎是中老年人劳动力丧失的原因之一，其主要病理变化包括关节软骨逐渐丧失，骨赘形成，以关节疼痛、畸形和关节功能丧失为特征，最终会导致患者生活质量的下降。根据最新人口统计数据，在中国的膝关节骨性关节炎的患病率为1.3%-11.1%，而对于在60岁或以上的人群，症状性膝骨关节炎的患病率为19.4%1。骨关节炎发生发展的实质为在不恰当的生物力学因素的作用下，关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的生理平衡失调，关节软骨的分解代谢明显大于合成代谢。关节发生骨关节炎时，各种基质金属蛋白酶表达和含量增高，这种改变在退变的早期首先见于关节

21、面或关节面周围，是介导骨关节炎软骨破坏的重要因子2-3。其中基质金属蛋白酶13能直接切断软骨的形胶原，是裂解型胶原作用最强的酶。基质金属蛋白酶13裂解型胶原使得软骨间质的分解增加，而软骨间质分子的降解产物自身又可促进进一步地降解，从而形成持续性的恶性循环，型胶原是软骨胶原网的主要成分，它与蛋白黏多糖一起赋予软骨弹性及形变能力4-6。如果胶原网被破坏，则不但能明显削弱软骨抵抗外界应力的能力，而且还会使软骨细胞暴露于众多炎性因子的攻击之下，使软骨基质成分游离出软骨，导致软骨破坏。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。姜黄素作为

22、天然的治疗癌症药物能够通过抑制核因子B的活性来降低肿瘤细胞存活扩散及引起的继发性炎症7-9。正因为姜黄素有效的抗氧化，清除氧自由基和抗肿瘤作用，现在已经进入临床试验9。在骨关节炎的病理和进展中，主要的活性氧物质为一氧化氮、过氧硝酸盐、超氧化物阴离子。这些因素不仅是参与软骨细胞凋亡的有毒物质，而且是细胞代谢重要的信号分子。姜黄素通过增加机体多种抗氧化酶如谷肤甘肤还原酶(glutathione reductase，GSR)，铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)等的活性，抑制氧化作用的酶，清除自由基，螯合金属离子

23、，完成抗氧化作用10-12。姜黄素的苯丙酞基是其抗炎的活性基团，能有效地使炎症介质产生减少。虽然姜黄素是一种特效的核因子B抑制剂，在细胞或分子水平对关节软骨细胞的影响还没有研究。本研究通过姜黄素作用于骨关节炎软骨细胞和正常软骨细胞，检测姜黄素对软骨细胞核因子B信号通路、细胞因子释放的影响，探讨姜黄素对骨关节炎的治疗作用机制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 分组对照细胞学实验。1.2 时间及地点 实验于2015年2至8月在上海交通大学医学院附属第九人民医院北部完成。1.3 材料 型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶为Sigma公司产品。DMEM培养液 、Ham

24、 F-12 培养液为 Gibco 公司产品。姜黄素、PDTC(核因子B抑制剂)购于MCE中国公司。新生小牛血清(FBS)系杭州四季青生物工程材料研究所生产。多克隆兔抗NF-B p65、山羊抗兔二抗购自 abcam公司。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、Western Blotting相关试剂、实时荧光定量RT-qPCR相关试剂购于碧云天公司。 常用药物的配制、贮存及使用方法：称取药物PDTC 82 mg，用1 mL溶剂DMSO溶解成浓度为 50 mmol/L的母液待用。称取药物姜黄素3.7 mg，用 1 mL 溶剂二甲基亚砜溶解成浓度为10 mmol/L的母液待用。避光4 保存。1.4 方法1

25、.4.1 动物模型建立 使用Hulth法制作大鼠骨关节炎模型，30只雄性SD大鼠购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量150-200 g。体积分数10% 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，随机选取15只，仰卧于手术台，取单侧膝关节剃毛、消毒铺巾后，取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。生理盐水冲洗切口，使用3-0缝线逐层关闭切口。另外15只做假手术对照，只切开关节腔，不破坏交叉韧带和半月板。同时使用头孢拉定500 mg 腹腔注射，1次/d，连续3 d。所有大鼠不固定伤肢，造模后7 d驱赶动物，30 min

26、/d，分2次驱赶，驱赶动物4周后即可获得明显的骨关节炎模型。番红O-固绿组织染色验证骨关节炎模型。1.4.2 软骨细胞分离培养 实验在上海交通大学医学院附属第九人民医院(北院)中心实验室完成。取造模后6-8周的大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠，截取大鼠膝关节，用 15 号解剖刀削下胫骨平台、股骨髁关节表面软骨，把适量软骨标本放入10无菌玻璃平皿中，倒入Gey平衡盐溶液(GBSS pH 7.0)淹盖标本为止。用解剖刀将软骨切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，移入第2个玻璃培养皿，并用GBSS淹盖。收集全部切碎的软骨，除去GBSS，加入4 mL透明质酸酶，室温下作用5 min。除去

27、透明质酸酶，另外加入8 mL新鲜透明质酸酶室温下作用10 min。表1 RT-PCR检测引物信息Table 1 Primers for RT-PCR analysis基因信息引物名称Primer sequence(5->3)Products备注rat-GAPDH-F1CCC CAA TGT ATC CGT TGT G124 bprat-GAPDH-R1CTC AGT GTA GCC CAG GAT GCrat MMP13-F1CGT TCA AGG AAT CCA GTC TCT C231 bprat MMP13-R1TCC ACA TGG TTG GGA AGT TCrat Col2a

28、1-F1GCA AGA ATC CCG CTC GCA158 bprat Col2a1-R1TGG GTT GGG GTA GAC GCArat P65-F1GAC CTG GAG CAA GCC ATT AG285 bprat P65-R1CAC TTT GTC ACA CAG CAA GAA GA除去透明质酸酶，用5 mL GBSS洗组织碎块2次，然后移入25 mL螺口试管中。去除GBSS，用胰蛋白酶洗组织碎块2遍，每次用2 mL。去除用过的胰酶，再加新鲜胰酶4 mL，37 ，搅拌状态下培养30 min。去除胰酶，用GBSS清洗2遍，每次用5 mL。用0.2%胶原酶2 mL清洗5 min，

29、去除清洗液。加入4 mL胶原酶，37 培养30 min，去除上清液。加入4 mL胶原酶，37 ，培养90 min。将上清液收集，600×g离心8 min，获得细胞团。把细胞悬浮于8 mLF12培养液中(含体积分数20%胎牛血清)，180×g，离心1 min以去除未消化的软骨基质。将上清液移入另一管，600×g离心10 min，收集细胞。把细胞悬浮于8 mL F12培养液中(含体积分数12%胎牛血清)在75 cm2培养瓶中培养，添加培养液到12 mL。型胶原免疫组织构建和甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。1.4.3 实验分组 阴性对照组：正常的关节软骨细胞。阳性对照组：成功

30、造模后的关节软骨细胞。姜黄素组：骨关节炎软骨细胞加入姜黄素(50 mol/L)。PDTC组：骨关节炎软骨细胞加入PDTC(10 mol/L)。每组软骨细胞全部是经过鉴定的原代软骨细胞。每组设 3 个复孔，每组均重复3次。作用时间为24 h。1.4.4 Western Blotting实验 按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白，采用BCA试剂盒定量，计算样品蛋白浓度。取30 g细胞胞浆蛋白和核胞蛋白进行聚丙烯酞胺凝胶电泳，按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉4 封闭2 h，滴加核因子B P65一抗(12 000) 4 过夜，TTBS洗膜10 min&#

31、215;4次，滴加二抗(14 000) 37 孵育2 h，TTBS洗膜10 min×4次，TBS洗膜10 min，按ECL试剂盒说明进行显色，Ge1Doc凝胶成像仪采集图像，Bandscan分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，并且均采用自身灰度值校正，以目的基因的条带密度与管家基因GAPDH或Lamin B1的密度比值表示蛋白的表达水平。1.4.5 免疫荧光法实验 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，3 min/次；用40 g/L多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，3 min/次；0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20 min；P

32、BS浸洗玻片3次，3 min/次，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(150)并放入湿盒，4 孵育过夜；加荧光二抗(1100)：PBST 浸洗爬片3次，3 min/次，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37 孵育1 h，PBST浸洗切片3次，3 min/次；复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封固，然后在荧光显微镜下观察采集图像。1.4.6 实时荧光定量RT

33、-qPCR实验 药物处理目的细胞，从药物处理后的细胞中抽提总RNA，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。RNA反转录成cDNA，根据目的基因序列信息设计并合成qPCR检测引物，序列见表1。RT-PCR预实验，以反转录的cDNA为模板，反应体系见表2。用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因，摸索适合qPCR上机的最佳引物退火温度和模板量，若有杂带应重新调整PCR过程中的退火温度，直至杂带消失。在RT-PCR预实验摸索出最佳的引物退火温度和模板量的前提下，使用2×SYBR Green Mix配制PCR Mix，根据需要上机的样品数和重复数，计算并配制PCR Mix(

34、2*SYBR GreenMix 10 L；引物Mix1 L；模板1 L)，将上述样品放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪，SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达，最后用Ct法进行CBA细胞形态 型胶原 糖胺聚糖图2 软骨细胞鉴定(倒置显微镜，×100)Figure 2 Verification of chondrocytes under an inverted microscope (×100)图注：图A为软骨细胞形态；B为免疫组织构建细胞染色显示型胶原；C为甲苯胺蓝细胞染色显示糖胺聚糖。BA图1 骨关节炎模型鉴定(番红-固绿染色，

35、15;100)Figure 1 Verification of a rat model of osteoarthritis图注：图A为骨关节炎模型组；B为正常组织组。与正常组织组比较，骨关节炎模型组软骨细胞数量、细胞外基质明显减少。表2 反转录反应液体系Table 2 The reverse transcription master mix5×reaction buffer4.1 LRiboLockTM Ribonuclease inhibitor(20U/L)0.6 LdNTP mix (10 mmol/L)2.1 LReverse Tra Ace1.1 LOligo(dT) pr

36、imer (0.5 g/L)1.1 L各基因表达的相对定量的数据分析。1.5 主要观察指标 骨关节炎模型鉴定。软骨细胞鉴定。姜黄素对骨关节炎软骨细胞核因子B P65 核转位的影响。姜黄素对骨关节炎软骨细胞型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响。1.6 统计学分析 采用 SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以±s表示，进行t 检验和方差分析(LSD 法)，显著性检验水平为P < 0.05。2 结果 Results 2.1 骨关节炎模型鉴定 经番红-固绿染色处理以后，大鼠膝关节的透明软骨和钙化软骨区呈红色，系软骨细胞外基质被番红O深染所致；软骨下骨区呈蓝色，

37、系骨细胞外基质被固绿染色所致；因此，软骨下骨与钙化软骨层之间界线明显，呈凸凹不平的梳齿状结构，透明软骨区可见淡染的软骨细胞陷窝，软骨下骨区可见散乱分布的骨细胞。正常膝关节组钙化软骨和软骨细胞外基质均多于模型组(图1)。2.2 软骨细胞鉴定 型胶原免疫组织构建染色时。软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，甲苯胺蓝染色可见软骨细胞内呈紫红色异染颗粒，细胞周围有少量异染颗粒出现(图2)。2.3 姜黄素对骨关节炎软骨细胞核因子B P65 核转位的影响 Western Blotting分析表明，在阳性对照组，核因子B P65主要要胞核内表达，胞浆中表达少；而在图3 Western Blotting检测核

38、因子B P65表达Figure 3 Protein expression of nuclear factor-kappa B P65 determined by western blot assay图注：阳性对照组P65主要在细胞核中表达，细胞浆中表达较少；姜黄素组P65主要在细胞浆中表达，细胞核中表达较少。P65GAPDHP65Lamin B1胞浆阳性对照组 姜黄素组 PDTC组 阴性对照组胞核阴性对照组、姜黄素组和PDTC组，核因子B P65主要要胞胞浆表达，胞核中表达少(图3)。免疫荧光分析发现，阳性对照组核因子B 均有不同程度的核转位，核转位细胞的核因子B P65荧光标记主要浓集于核区

39、，胞质区减少；阴性对照组、姜黄素组和PDTC组核转位细胞的核因子B P65荧光标记主要浓集于胞质区，核区减少(图4)。2.4 姜黄素对骨关节炎软骨细胞型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响 RT-qPCR分析发现，阳性对照组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白阳性对照组 姜黄素组 PDTC组 阴性对照组图4 免疫荧光观察P65在细胞内外表达情况(×400)Figure 4 Immunofluorescence staining for localization of nuclear factor-kappa B in chondrocytes (×400)图注：阳

40、性对照组核因子B 均有不同程度的核转位，核转位细胞的核因子B P65荧光标记主要浓集于核区；阴性对照组、姜黄素组和PDTC组核转位细胞的核因子B P65荧光标记主要浓集于胞质区。Ba型胶原mRNA的表达aaaa0.60.301.21.00.20A基质金属蛋白酶1m RNA的表达a阳性对照组 姜黄素组 PDTC组 阳性对照组阳性对照组 姜黄素组 PDTC组 阳性对照组基质金属蛋白酶13 m RNA的表达1.00.20C图5 实时荧光定量RT-qPCR检测姜黄素对骨关节炎软骨细胞型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响Figure

41、 5 Effects of curcumin on mRNA expressions of matrix metalloproteinase-1 and -13 and type II collagen in chondrocytes in rats with osteoarthritis图注：图A为型胶原mRNA表达；B为基质金属蛋白酶1 mRNA表达；C为基质金属蛋白酶13 mRNA表达。与阳性对照组比较，aP < 0. 01。a阳性对照组 姜黄素组 PDTC组 阳性对照组aa酶13表达增高，而型胶原较少；相反的，在阴性对照组、姜黄素组和PDTC组，基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶1

42、3表达受到抑制，而型胶原表达增高(图5)。3 讨论 Discussion核因子B是一种在细胞浆中广泛表达的转录因子，p65-p50二聚体是其主要的存在形式。当细胞处于静息状态时，核因子B通过与抑制性蛋白IB结合，从而以无活性的形式存在于细胞质中13。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子产生的第二信使信号导致IB的磷酸化和泛素化，继而被降解14，核因子B脱离了IB阻滞，而转位至细胞核，p65的核转位是核因子B信号转导通路活化的重要标志。活化的核因子BP65进入细胞核与其靶基因调控区域的特异性DNA序列接合15，靶基因转录被激活，导致多种趋化因子及细胞因子如白细胞介素6、肿瘤坏

43、死因子、P-sel、ICAM-1等的表达，核因子B通过调控细胞因子、生长因子、黏附分子、趋化因子以及多种酶的基因表达，从而在炎症、免疫反应、细胞凋亡、及肿瘤形成中扮演了重要角色16。 有研究证实，骨关节炎的炎症反应过程中涉及的众多细胞因子的基因表达，皆由核因子B信号转导通路所激活，核因子BP65一旦被激活，由它介导细胞所产生各种炎症分子、细胞因子以及一些酶类，导致软骨细胞肥大、凋亡及功能异常等17。故目前认为，核因子B信号转导通路的激活可能是骨关节炎发生发展的重要机制之一，同时核因子B是第一个被证实能直接对氧化应激起反应的转录因子，氧化应激可以诱导核因子B胞质核转位，而抗氧化剂如NAC，PDT

44、C等能抑制IB激酶的活性，阻止其被磷酸化和最终降解，抑制核因子B的转位18。因此，氧化应激NF-KB的关键环节可能是通过信号转导的级联反应而引起的IB的磷酸化和最终降解19。目前，国内外均有研究证实，姜黄素对于由炎症因子介导的关节退变中，有抑制关节软骨降解的作用，姜黄素通过直接抑制IB的磷酸化，而抑制核因子B的活化，使其无法进入细胞核内有特定靶基因序列DNA结合20。但姜黄素对软骨细胞保护作用的确切机制目前尚有待进一步阐明。在本研究中，通过建立大鼠创伤性骨关节炎模型，提取原代软骨细胞进行体外实验，免疫荧光分析发现，姜黄素及PDTC处理组，软骨细胞核内核因子B P65的荧光强度明显低于阳性对照组

45、(P < 0.05)，Western Blotting分析也表明，与阳性对照组相比，姜黄素及PDTC处理组细胞核的NF-B P65蛋白的表达显著降低(P < 0.05)，以上结果表明，姜黄素对于骨关节炎的治疗可能主要通过抑制NF-B 信号通路的激活。基质金属蛋白酶通过裂解细胞外基质，从而介导软骨基质的破坏和骨性关节炎进展过程中重塑20，关节软骨通过产生基质金属蛋白酶促使软骨细胞病理性激活，进而导致局部关节组织的分解19。而在众多的基质金属蛋白酶蛋白家族分子中，基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13作为诱导软骨损伤的分解因子，在骨性关节炎的炎症进展中起着尤为重要的作用

46、20。在骨关节炎中，基质金属蛋白酶的上调被认为是降解细胞外基质的关键分子事件，因此，针对基质金属蛋白酶的治疗有望成为骨性关节炎重要靶向治疗方法之一。研究发现，在基质金属蛋白酶1，基质金属蛋白酶9以及基质金属蛋白酶13的基因启动子部位，含有一个核因子B的结合位点，核因子B的激活对于基质金属蛋白酶表达的上调是必需的20。另有研究提示，在骨关节炎中，与正常对照组相比，核因子B的表达、活化水明显增高，基质金属蛋白酶9和白细胞介素1的转录水平也显著高于正常对照组，且和核因子B的活化水平呈正相关21。型胶原是软骨基质的主要和重要组成部分，在关节炎的发病机制中，由型胶原所组成的关节软骨细胞外基质的降解是导致

47、关节破坏的主要原因21。体外实验证实，软骨细胞是非增殖性的，且特征性的表达型胶原。基质金属蛋白酶通过裂解细胞外基质，从而介导软骨基质的破坏和重塑22。尤其是基质金属蛋白酶1，通过特征性地降解关节软骨促进骨关节炎的进展23。当基质金属蛋白酶1 在特定位点切割而产生3/4N末端和1/4 C末端片段，型胶原即被降解3。以往研究表明，多条信号通路涉及到对于基质金属蛋白酶表达的调控，包括ip38，ERK，JNK，AP-1和核因子B信号通路19。Shakibaei等24的研究表明姜黄素可以显著降低由白细胞介素1诱导的人软骨细胞环氧化酶2和基质金属蛋白酶9的表达，其机制与抑制核因子B的活性有关。本研究中进一

48、步RT-qPCR分析发现，与阳性对照组相比，姜黄素及PDTC处理组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达明显降低(P < 0.05)，而型胶原表达显著上调(P < 0.05)，综合免疫荧光及Western Blotting结果，作者推测姜黄素对基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的抑制，及对型胶原表达的上调是通过抑制核因子B P65的核转位实现的。在骨关节炎的治疗中，维持正常的软骨基质代谢，降低软骨的降解是非常重要的。一种理想的骨关节炎的治疗方法，不仅需要阻断炎症因子所介导的软骨破坏，还要提高软骨基质的稳定性。本研究的结果表明，姜黄素对于软骨细胞的保护作用可能主要通过抑制核因

49、子B P65的核转位，从而抑制核因子B信号通路，进而抑制基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达，及上调型胶原的表达，最终实现对软骨细胞的保护作用，延缓关节的退化。姜黄素作为一种代表性的植物来源药物，因其所具有的明显抗炎、抗氧化作用，几乎无胃肠道等不良反应的特点，其应用越来越受到重视。对于姜黄素在骨关节炎治疗中的应用，其有效性仍然需要长期大样本的临床前瞻性研究来支持。实验在一定程度上为姜黄素防治由骨关节炎引起的软骨退变提供了可靠的实验依据。作者贡献：所有作者共同进行实验的设计、实施及评价，采用盲法评估。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的

50、手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Shi D,Dai J,Xu Z,et al.Update on basic and clinical aspects of osteo

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