艾滋病实验室的质量管理3

1、hiv实验室的质量控制及规范化管理 吉林省疾病预防控制中心 臧希卉 实验室质量管理包括质量保证、质量控制和质量评价。 质量保证是指从接收样本起，到实验室发出报告止，为确保实验室最终报告结果的正确性所进行的全过程，包括采取各种行政和技术上的措施和方法。l行政支持（行政部门关心实验室发展、建设，人员稳定，足够经费）l人员培训l（新人员上岗前培训获得合格证书，接受复训，筛查实验室人员至少2年一次。检测人员应分为检验人、复核人、签发人。复核人和签发人应具备对检测过程进行分析和解决问题的能力）l环境条件（实验室设置、建筑、设备符合要求）l标本采集、运送和处理l检测方法和试剂的选择l设备维护与校准 （酶标

2、仪、洗板机、移液器校准，冰箱、孵箱及其他仪器定期检查）l文件和文件管理 l使用经国家食品药品监督管理局注册批准的试剂，选择敏感性高，特异性好的，根据参比室组织的国家级艾滋病诊断试剂临床质量评价l各实验室更换试剂批号时，应进行平行试验l所有试剂盒要严格按照要求条件保存，试剂盒拆封时要记录拆封时间。 设备维护与校准l安全类：生物安全柜、洗眼器、普通冰箱、超低温冰箱、自动高压消毒柜l检测类：微量加样器、摇摆平台、全自动蛋白印迹仪、普通离心机、震荡器、移液器、 恒温水浴、酶标仪+洗板机、病毒载量仪、流式细胞仪l其它：计算机、空调l遵照全国艾滋病检测工作规范l检测质量保证l延长设备的使用时间l便于设备的

3、管理l节约资源l日常维护日常维护l定期检定和校准定期检定和校准l电源：电压一定要匹配，插线板合适，电源：电压一定要匹配，插线板合适，专用的专用的. .经常停电或电压不稳的实验室，经常停电或电压不稳的实验室，建议配备稳压器和不间断电源建议配备稳压器和不间断电源l环境：清洁，温、湿度合适环境：清洁，温、湿度合适l良好通风良好通风l长时间不用的设备，注意特别容易坏长时间不用的设备，注意特别容易坏（1 1）elisa elisa 洗板机与酶标仪洗板机与酶标仪 ：每天：每次操作要按要求设立对照。核对酶标仪滤光片波长，检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象。每月：洗涤时检查各孔是否与相应的冲洗头对位良好，

4、负压是否符合规定要求，这是保证各孔洗涤均衡一致的前提。每年：检查、清洗滤光片，如果滤光片出现破裂或霉点则要更换，根据仪器内具有的校准程序或使用校准板，对滤光片的所用波长光密度的精密度进行校验， 测定20次，计算精密度。精密度应该控制在厂家说明书中所规定的范围 ( 建议请厂方代表校验 )。校验结果要有记录，保留测定原始结果。 根据实际使用情况更换主要设备内的所有液体装置和管子(要求厂方代表维修 )。l一年至少校准一次一年至少校准一次l需校准的原因需校准的原因 - -经常使用经常使用 - -要求高的准确性要求高的准确性 - -要高压灭菌要高压灭菌l- -用于移高粘稠性、高密度溶液用于移高粘稠性、高

5、密度溶液 - -温度变化大温度变化大l移液器移液器: 用蒸馏水称量标定移液器方法(参考芬兰labsystems移液器标定方案)l 在一室温为22 的小型工作室(无风)中，在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶，用待标定的移液器吸取蒸馏水( 隔夜存放 )加入小三角烧瓶内底部，每次称重后计量，去皮重后再加蒸馏水，连续加蒸馏水10次。加蒸馏水的量根据待标定的移液器不同规格而不同，见下表。移液器标定合格后，在移液器上贴上合格标签，标明日期。在移液器标定记录中填写移液器规格、编码、10次标定称量、标定日期和标定人签名。移液器10次标定称量在所要求的重量范围内为合格移液器；不合格移液器要根据移液器生产厂家

6、所推荐的方法进行校准。 移液器规格标定使用蒸馏水量要求重量范围 0.5 - 10 l 2 l 1.75 - 2.25 mg 5 - 40 l 10 l 9.8 - 10.2 mg 40 - 200 l 70 l 69.4 - 70.6 mg 200 - 1000 l 300 l 298.0 - 302.0 mg 1 - 5 ml 2000 l 1990.0 - 2010.0 mg 2 - 10 ml 3500 l 3485.0 - 3515.0 mgl定期清理灰尘过定期清理灰尘过滤器（建议每月滤器（建议每月一次）一次） l要求环境温度控制在要求环境温度控制在2828度以下度以下l空间的清洁空间

7、的清洁l稳定的电源供应稳定的电源供应l不宜放得太挤不宜放得太挤lhepa-hepa-过滤装置容纳过滤装置容纳有害生物气体。有害生物气体。 l需提供人员保护需提供人员保护l也为产品提供保护也为产品提供保护 ( (按等级而定按等级而定) )l每年检定一次安全柜每年检定一次安全柜l保持所有操作在窗扇保持所有操作在窗扇4 4英寸以内英寸以内l清洁物质和污染物隔离开，减少相清洁物质和污染物隔离开，减少相互干扰互干扰l使用后及时清理使用后及时清理l堵窗扇堵窗扇l柜内不宜放太多的物品，不能储藏柜内不宜放太多的物品，不能储藏化学物质化学物质l离心力、离心速度l平稳的仪器台l不用时，松转头；使用时，拧紧l转子保

8、持平衡l使用安全：盖子要严l使用后要擦干或开盖至晾干l防止液体泄漏到腔内l压力表需要定期检验l等气压和温度下降到正常后,再开阀l高压时,放入指示纸,以便判定灭菌效果 对检验的准确性和有效性有影响的对检验的准确性和有效性有影响的仪器设备必须进行检定和校准。仪器设备必须进行检定和校准。 有国家计量检定规程的仪器设备，由法有国家计量检定规程的仪器设备，由法定计量检定机构或经计量行政部门授权定计量检定机构或经计量行政部门授权的技术机构进行检定；的技术机构进行检定； 没有国家检定规程的，可以由厂家、自没有国家检定规程的，可以由厂家、自行检定和校准。行检定和校准。l制订仪器设备检定计划。制订仪器设备检定计

9、划。 l经检定的仪器设备校验结果贴上标志：经检定的仪器设备校验结果贴上标志：合格标志为绿色、准用标志为黄色、停合格标志为绿色、准用标志为黄色、停用标志为红色。用标志为红色。 l凡检定不合格或超过检定有效期的仪器凡检定不合格或超过检定有效期的仪器设备，一律不得用于检验工作。对超过设备，一律不得用于检验工作。对超过检定期，但暂时不用的仪器设备，贴上检定期，但暂时不用的仪器设备，贴上停用标志。停用标志。 hiv hiv检测强制检定仪器：检测强制检定仪器： 加样器、酶标仪加样器、酶标仪/ /洗板机、温度计、高压灭洗板机、温度计、高压灭菌器菌器 l强制检定的周期，由执行强制检定的计强制检定的周期，由执行

10、强制检定的计量检定机构根据计量检定规程确定。量检定机构根据计量检定规程确定。属于强制检定的工作计量器具，未按照属于强制检定的工作计量器具，未按照本办法规定申请检定或者经检定下合格本办法规定申请检定或者经检定下合格的，任何单位或者个人不得使用。的，任何单位或者个人不得使用。 艾滋病检测实验室要建立覆盖主要工作内容的sop文件。 sop由各岗位工作人员起草，实验室主任审定，并应定期修订。修订应该在实验室主管人员的领导下进行，每年至少一次。所有工作人员要在所从事工作的sop文件上签名表示已经阅读并掌握了有关内容。.（1）标题和编号（2）编写和修改日期（3）编写和修订人员姓名（4）方法、目的和应用范围

11、（5）相应的职业规范（6）检测设备和试剂（7）安全防护相关步骤（8）结果的解释和报告（9）附录（包括相关的附加文件如标准表格、设备和试剂盒说明书等。） l1、样品的接收、登记、处理、保存和运输l2、检测方法和步骤l3、试剂使用方法和保存l4、仪器的使用维护和校准l5、实验中的质量控制要求及程序l6、结果解释与报告l7、保密程序l8、实验室数据、相关文件记录与保存l9、不确定样本的追踪和处理l10、实验室安全防护及实验室的的清理和消毒 应按实验要求，设计操作的原始记录表，标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置，便于指导实验人员加样。要注明试剂厂家、测定方法、批号、有效期、操

12、作人员和复核人员姓名及检测日期。02elisa表格.doc04快速原始记录表.doc09实验室样本交接记录.doc10艾滋病确证实验室实验室结束后清理工作记录.doc08高压灭菌器.doc17移液器自校准记录.doc 分析结果及发出检测报告前，应注意须在试剂盒及外部质控结果满足要求的前提下，对样品进行分析。试剂盒及外部质控不合格，样品需要重新检测复核人对检测结果进行仔细复核并对结果提出结论签发人对试验结论进行审核、分析、总结、签字 收到样品后，建立唯一编码，及时登记有关信息，包括受检者姓名或代号、试管编号、性别、职业、送检单位、人群类别、检测结果、送检日期、报告日期、通讯地址 实验原始记录表、

13、打印数据、膜反应条带或其照片、检测记录表、标本登记、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等都应该妥善存档保存10年以上。最好同时使用计算机保存各种文件和记录。 质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一步实验过程中必须采取的各种措施。 是对检验结果的即时性评价，通过对质控结果的连续观察，监测实验室结果的精密性。在所有实验中必须包含有试剂盒内部对照质控血清和室内质控品（外部对照质控血清）。1、试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能做为室内质控品使用。内部对照是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中

14、使用。内部对照结果无效必须重新实验。l2、室内质控品（外部对照）为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（cut off）的2-3倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样本检测的有效性，因此，每次实验必须包含室内质控品，其结果无效，必须重新实验。室内质控品可以是商品或实验室自行制备 收集hiv抗体阳性和阴性血清，5630分钟灭活，3000rpm离心15分钟。弱阳性对照可以用hiv抗体阴性血清梯度稀释hiv抗体强阳性血清并标定后得到。按一年使用量配制，用0.2m滤膜过滤除菌。l1 阴性样本 阳性样

15、本（od0.407； 3.254）l2 用阴性样本稀释阳性样本 （cutoff=0.174） 1：10 ；1：100； 1：1000； 1：2000，4000，5000，6000，8000，10000。 假设1:8000=0.514（0.3480.522） （1）按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20冻存。（2）外部对照血清不可反复冻融，一旦融化后应该存放2-8，一周内使用。 每一次实验必须使用室内质控品，以便监控实验的重复性。同时可以了解各批试剂盒的批间差异或孔间差异，绘制质量控制图。 l最常用的质控图是levey-jennings质控图，该图使用累计和技术或趋势分析技术的图形提供系统

16、偏移和漂移的状况。l下面以elisa方法检测hiv抗体为例，描述建立质控图步骤：1.建立质控图参数2.绘制质控图3.质控图的判断和分析4.考察试验系统的可靠性可采用多标准 质控方案的要点5.绘制和分析质控图的要点6.变异系数（cv）分析7.灰区 （1）算术平均值( x )代表一组s/co值的平均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次(天)所测得的外部对照质控血清s/co值结果计算出平均值。 （2）标准差(s)是描述样本与均数之间离散程度的一个指标，是与对照值的均值有关的预期范围。一组s/co值的标准差以s表示。 （3）控制限：外部对照s/co值的 2s （4）变异系数(cv)，是反映

17、各次 s/co 值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。计算公式为： x x = n s 计算公式为： ( xn - x )2 s = n-1 cv 计算公式为： s cv = x 100 % x 质控图是把检测数据与计算出的“控制限”进行比较的图，包含一条中心横线和其上、下两条平行的控制线，并有按时间顺序点入的质控血清测定值。 （1）在常规条件下，对同一批血清连续测定20次（天）或以上，获得一组s/co值，求均数(x )和标准差(s), 超出2s或3s的数据不应删除。 （2）将均值(x )和标准差(s)分别在质控框架图中标示出来。以s/co值作纵座标(y轴)，每一次

18、(天)试验作横座标(x轴)，绘制质控图。 （3）从第21次起，将每次检测的质控血清的结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。 （4）建议将内部对照质控血清和外部对照质控血清的结果绘制在同一个质控图中。 l艾滋病实验室的质量管理2006质控图.xls （1）告警：外部对照的s/co值超出2s，系统处于告警状态，应予以注意，是否可以继续检测需要进一步观察。 ( 2 )失控：外部对照的s/co值超出3s，称为失控，则本次实验结果不能被接受。可能是系统误差或外部对照滴度下降造成。 （3）移漂：连续几个（3-5次）外部对照s/co值都落在均值的一侧则称为位移，提示实验条件发生了较大的变化。应重新绘

19、制质控图。 （4）趋势：连续几个（5-7个）外部对照质控血清s/co值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。 （1）要在最佳条件下建立质控图参数。 （2）用s/co比值绘制质控图。 （3）由专人负责建立质控图，每月定期召开质控分析会，讨论本月的质量控制情况。每次检测之前都应了解质控结果。 （4）建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒。 （5）更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒如结果偏离较大也应重新制作质控图。使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用日期。 （6）如发现质控值剧烈位移或失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出

20、检测报告。 （7）使用新批次的外部对照质控血清时，必须重新绘制质控图。 （8）发现质控结果失控 5、变异系数（cv）分析变异系数(cv)小于20，表示外部对照处于稳定状态。 6、灰区通常把临界值上下10的范围定为灰区，对灰区标本应进行复测。 “ “即刻法即刻法”质控统计方法，在连续测质控统计方法，在连续测3 3次后，次后，即可对第即可对第3 3次检验结果进行质控。次检验结果进行质控。具体计算方法如下：具体计算方法如下：l1 1）将测定值从小到大排列：）将测定值从小到大排列：x x1 1，x x2 2，x x3 3x xn n(x(x1 1为为最小值，最小值，x xn n为最大值为最大值) )l2 2）计算）计算x x和和s sl3 3）计算）计算sisi上限值上限值和和sisi下限值下限值l lsisi上限上限=(x=(x最大值最大值-x)/s-x)/s si si下限下限=(x-x=(x-x最小值最小值)/s)/snn3sn2snn3sn2s31.161.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.712.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822