车前草提取黄酮物降低急性高尿酸血症小鼠血尿酸水平

1、车前草提取物黄酮降低急性高尿酸血症小鼠血尿酸水平1.目的：探讨车前草提取物黄酮对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响2.国内外前景：痛风( gout) 是由于嘌呤类物质代谢紊乱，产生尿酸过多和( 或) 尿酸排泄减少，血尿酸浓度持续增高导致尿酸盐结晶沉积软组织所致的一组代谢性疾病，高尿酸血症是痛风最重要的生化基础。随着人们生活水平的不断提高和饮食结构的改变，痛风和高尿酸血症的患病率在全球范围呈逐年上升的趋势。现有的用于治疗痛风的药物副作用比较多。相对于秋水仙碱、苯溴马隆等药物，临床使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇相对安全，但仍有约2%的病人治疗3 周后可见皮疹及皮肤瘙痒，继续用药会造成过敏综合症1，

2、需要终止治疗。最新在美国批准上市的另一种黄嘌呤氧化酶抑制剂抗痛风药物非布索坦其安全性并没有高于别嘌呤醇2。因此从天然草药中寻找更为安全的抗痛风替代药物仍是药学研究的热点。3.发展趋势：车前草具有一定的抗痛风效果，在体外对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用3，但其抗高尿酸血症及机理研究报道较少。另外，中草药抗痛风药物研究其机理仍主要集中在黄嘌呤氧化酶及肾尿酸转动蛋白作用靶点，而对其它作用靶点研究较少。本研究在建立氧嗪酸钾盐诱导的小鼠急性高尿酸血症模型的基础上，深入探讨车前草对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响及其作用机理，以期为其抗痛风药用开发提供参考。4. 实验原理：车前草提取物黄酮能够降低高尿酸血症模型

3、小鼠的血尿酸，改善高尿酸血症小鼠肾脏功能。黄嘌呤氧化酶是调控尿酸生成的最终环节，在高尿酸血症的发病中占有重要的地位。同时，腺苷脱氨酶ADA 是腺苷酸分解代谢的重要酶之一，在嘌呤分解代谢中具有重要作用。最新研究表明，ADA 活性的增加会升高机体体内黄嘌呤与次黄嘌呤的浓度6，7，进而影响尿酸的代谢。车前草提取物黄酮抑制XOD 与ADA 活性并下调肾脏mUAT1mNA 的表达是其降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的作用机制。5.实验对象：车前草采自江西九江，经江西中医学院中药资源教研室张寿文教授鉴定为车前科植物车前草Plantago asiatica L的干燥全草。6.实验动物：60 只成年雄性小鼠。7

4、.实验器械及药物 7.1实验器械：高速冷冻离心机，超低温冰箱，电热恒温水温箱，电子分析天平，旋转蒸发器，UV2100紫外可见分光光度仪，PC 扩增仪，XOD 测定试剂盒，考马斯亮蓝蛋白测试盒，ADA 测定试剂盒，尿酸测定试剂盒，动物NAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒。7.2实验药物：氧嗪酸钾盐，别嘌呤醇片，双蒸水M MLV 反转录酶，车前草提取物黄酮，生理盐水。8.实验方法：1 车前草总黄酮提取：国内外研究车前草总黄酮提取工艺已较多,本课题选用了文献报道中的最优提取方案7, 8 ,能最大限度地提取到黄酮类成分,也为车前草黄酮提取物及其饮片中黄酮类成分的检测提供了方法。2 样品对高

5、尿酸血症小鼠的影响2 1小鼠分组及给药将60 只小鼠随机分为6 组，每组10只，分别为空白对照组、高尿酸血症组( 模型组) 、别嘌呤醇组( 阳性药组) 、车前草低剂量组、车前草中剂量组和车前草高剂量组。其中车前草低、中、高剂量组给药剂量分别为117，234，468 g /kg，别嘌呤醇混悬于08% CMCNa中，其剂量为10 mg /kg。空白对照和模型对照组，灌胃给予相应体积的生理盐水。按0 15ml /10g 灌胃给药。连续给药7 d，每天一次，最后一次于造模1h后给药。2 2 高尿酸血症小鼠模型的建立采用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾盐为化学诱导剂，抑制小鼠体内尿酸分解，造成小鼠高尿酸血症模型。于

6、给药前1 h，按照400 mg /kg 剂量，对小鼠腹腔注射氧嗪酸钾盐( 混悬于08% CMCNa 溶液) 。空白对照组腹腔注射相应体积08% CMCNa 溶液。给药1 h 后，小鼠眼眶后静脉丛采血，全血10000 r /min 离心10 min，离心后上层血清置于4冰箱中备用。并于冰台快速分取肝脏组织块与肾脏，立即投入液氮中冷冻，取出后置于70冰箱中保存。2 3 血清尿酸与肌酐水平检测采用尿酸测定试剂盒与肌酐测定试剂盒。2 4 肝脏黄嘌呤氧化酶( xanthine oxidase，XOD) 及腺苷脱氨酶( Adenosine deaminase，ADA) 活性测定肝脏组织块称重后按体积比加9

7、 倍预冷的生理盐水制成10%匀浆，2500r /min 离心10 min，取上清按照试剂盒规定方法测定蛋白含量和XOD 及ADA活性。2 5 TPC 法测定肾脏尿酸转体mUAT1 mNA 表达每组取10个肾脏样品，每个样品0 02 g，加入300 l 裂解液，按照试剂盒说明书提取总NA。取总NA 1l，加DEPC 水稀释后，在260、280 nm下测定吸光度( A)值，以A260 /A280值确定其纯度。利用12% 琼脂糖凝胶电泳方法鉴定，在紫外灯下观察总NA完整性。取8l 总NA，按照Promaga 反转录酶使用说明书上操作步骤进行反转录，合成cDNA。引物序列和PC 扩增反应按照文献4中所

8、述进行。简言之，引物序列分别为mUAT1 ( 5'GCTACCAGAATCGGCACGCT 3'5' CACCGGGAAGTCCACAATCC 3') ，GAPDH ( 5'GAGAAGATTTGGCACCACAC 3'5'CATCACAATGCCAGTGGTAC3') 。PC反应体系总体积25l。mUAT1 基因和GAPDH 基因扩增条件为95 预变性2 min;94变性30 s，58退火35 s，72延伸45 s，共35个循环; 72延伸10 min。PC扩增产物20保存。PC 产物经12% 琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色后，在

9、凝胶影像分析仪上进行成像，并对条带进行吸光度分析。计算待测基因与GAPDH 的比值，从而得到待测基因的相对表达值。2 3 数据处理采用Studentst检验双尾分析，结果以珋x ± s 表示。9.观测指标： 血清尿酸与肌酐水平检测 采用尿酸测定试剂盒与肌酐测定试剂盒。 肝脏黄嘌呤氧化酶( xanthine oxidase，XOD) 及腺苷脱氨酶( Adenosine deaminase，ADA) 活性测定 RT-PCR 法测定肾脏尿酸转体 mUAT1 mNA 表达 10.预期结果：样品对高尿酸血症小鼠血清尿酸及肌酐水平的影响 高尿酸血症模型组小鼠血清尿酸水平显著地高于正常 。阳性对照

10、药别嘌呤醇在给药剂量为nmg/kg 时能显著地降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，与模型组小鼠血清尿酸水平有极显著性差异，并且将小鼠血清尿酸水平降低到正常小鼠以下，与正常小鼠血清尿酸水平也有较显著差异。车前草低、中、高剂量组均可显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平。高尿酸血症模型组小鼠血清肌酐水平显著地高于正常小鼠血清尿酸水平。阳性对照药别嘌呤醇能显著地降低高尿酸血症小鼠血清肌酐水平，与模型组小鼠血清肌酐水平有极显著性差异，并且将小鼠血清肌酐水平降低到正常小鼠水平以下。车前草低、中、高剂量组均可降低高尿酸血症小鼠血清肌酐水平。 表1 车前草和别嘌呤醇对高尿酸血症小鼠血清尿酸与肌酐水平的影响( x &

11、#177; s)组别 给药剂量/g·kg 1 血清尿酸/mol·L 1 血清肌酐/mol·L 1空白对照组高尿酸血症组别嘌呤醇组车前草低剂量组车前草中剂量组车前草高剂量组样品对高尿酸血症小鼠肝脏 XOD 及 ADA 活性的影响 车前草低剂量组对肝脏黄嘌呤氧化酶抑制作用不明显，而别嘌呤醇组和车前草中、高剂量组对高尿酸血症小鼠肝脏 XOD 活性均有一定抑制作用。高尿酸血症能显著提高肝脏 ADA 的活性，别嘌呤醇组对高尿酸血症小鼠肝脏 ADA 的活性几乎没有抑制作用，但车前草低、中、高剂量组对高尿酸血症小鼠肝脏 ADA 活性均有较强抑制作用。 表2 车前草和别嘌呤醇对高

12、尿酸血症小鼠肝脏XOD 及ADA 活性的影响( x ± s)组别 给药剂量/g·kg 1 XOD 活性/U·g 1 ADA 活性/U·mg 1空白对照组高尿酸血症组别嘌呤醇组车前草低剂量组车前草中剂量组车前草高剂量组 样品对高尿酸血症小鼠肾脏尿酸转运体 mUAT mNA 的表达影响。与空白对照组比较，模型组肾脏 mU AT1 mNA 提高。与模型组比较，不同剂量车前草给药组、别嘌呤醇组均显著抑制 mUAT1 mNA 的表达11.创新之处：黄酮类化合物具有广泛的药理作用。植物中提取的一些黄酮类，如芦丁、槲皮素有降尿酸效果，表现出一定的抗痛风作用8。车前草中

13、含有大量的黄酮类化合物，可能为其抗痛风作用的有效成分，这有待进一步研究。参考文献1 Okamoto KInhibitors of xanthine oxidoreductaseJ Nihon Rinsho，2008， 66( 4) : 7482 Smith HS，Bracken D，Smith JM Gout: current insights and future perspectivesJ J Pain，2011， 12( 11) : 11133 Kong LD，Cai Y，Huang WW，et al Inhibition of xanthine oxidase by some Chin

14、ese medicinal plants used to treat goutJ Ethnopharmacol，2000， 73( 1 2) : 1994 Wang X，Wang CP，Hu QH， et al The dual actions of Sanmiao wan as a hypouricemic agent: down regulation of hepatic XOD and renal mUAT1 in hyperuricemic miceJ J Ethnopharmacol， 2010，128: 1075 Kutzing MK ，Firestein B L Altered

15、uric acid levels and disease statesJ J Pharmacol Exp Ther，2008，324 ( 1) : 16 Kaminsky Y，Kosenko E AMP deaminase and adenosine deaminase activities in liver and brain regions in acute ammonia intoxication and subacute toxic hepatitisJ Brain es，2010，1311: 1757 高中松,彭密军,黄智敏等. 车前草中总黄酮的提取研究 J . 现代农业科技, 2006, 5( 5): 31 32.8 Zhang Y, Jiao J J, Liu C M et al . Isolati on and Purif i-Cation of f ou r Fla-vone C-Glycosidesf romantioxidan t