胰酶联合Ⅱ型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择

1、www.CRTER.org张存鑫，等. 胰酶联合型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择胰酶联合型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择张存鑫，马进峰，王德春(青岛大学附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266000)引用本文：张存鑫，马进峰，王德春. 胰酶联合型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择J.中国组织工程研究，2016，20(20):2899-2906.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.002 ORCID: 0000-0003-1296-2883(王德春)文章快速阅读：最适宜髓核细胞体外生长的葡萄糖浓度张存鑫，男，

2、1988年生，汉族，山东省济宁市人，青岛大学在读硕士。通讯作者：王德春，博士，教授，青岛大学附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266000中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)20-02899-08稿件接受：2016-03-30http:/WWW.胰酶型胶原酶兔髓核细胞结论：培养基的葡萄糖浓度为17.5 mmol/L时，比较适宜髓核细胞的体外培养培养基中葡萄糖浓度0，6.25，12.5，17.5，25 mmol/L筛选文题释义：胶原酶：是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或

3、胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶分为，型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。髓核：是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。摘要背景：椎间盘退变是脊柱退行性疾病的发病基础，研究椎间盘的退变因素，对脊柱退行性的疾病的预防和治疗有重要意义。目的：采用胰酶联合型胶原酶消化法体外分离培养兔髓核细胞，并观察髓核细胞在不同葡萄糖浓度培养基中的生长及增殖状况，确立最适宜髓核细胞生长的葡萄糖浓度。方法：胰酶联合型胶原酶消化法分

4、离、培养兔髓核细胞，倒置显微镜观察细胞形态并计数细胞数量，绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色观察细胞形态。细胞免疫组织化学染色结合免疫荧光染色检测型胶原蛋白表达情况。分别使用0，6.25，12.5，17.5，25 mmol/L葡萄糖培养基培养髓核细胞24 h后，检测各组髓核细胞增殖及凋亡情况。 结果与结论：髓核细胞形态：兔髓核细胞染色后镜下观察呈多角形、短梭形，有一两个核仁，随着传代次数增加，细胞伸出伪足，胞体逐渐变细长；基因表达：体外分离培养髓核细胞的型胶原蛋白及聚集蛋白多糖基因均可稳定表达；细胞增殖：各组中细胞增殖比率以葡萄糖17.5 mmol/L组最高，显著高于葡萄糖0，25

5、mmol/L组(P < 0.05或P < 0.01)；细胞凋亡：葡萄糖0 mmol/L组细胞凋亡率最高(P < 0.05)，其他各组差异无显著性意义(P > 0.05)。结果证实：胰酶联合型胶原酶消化法可收获较多的原代髓核细胞，葡萄糖浓度17.5 mmol/L比较适宜髓核细胞体外培养。关键词：组织构建；软骨细胞；髓核细胞；培养基；椎间盘；葡萄糖；细胞培养技术；细胞增殖；型胶原；聚集蛋白多糖；型胶原酶消化法；国家自然科学基金主题词：组织工程；椎间盘；细胞凋亡；葡萄糖基金资助：国家自然科学基金(21472104)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004

6、kf23385083Trypsin plus type II collagenase digestion for isolation of nucleus pulposus cells: the optimal glucose concentration in complete mediumZhang Cun-xin, Ma Jin-feng, Wang De-chun (Department of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, C

7、hina)AbstractBACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is the pathological basis of degenerative spinal diseases. Studies on the influential factors of intervertebral disc degeneration contribute to the prevention and treatment of degenerative spinal disease.OBJECTIVE: To observe the growth and p

8、roliferation of nucleus pulposus cells isolated by trypsin plus type II collagenase digestion in complete medium with different glucose concentrations, exploring the optimal glucose concentration for growth of nucleus pulposus cells.METHODS: Nucleus pulposus cells isolated and cultured by trypsin pl

9、us type II collagenase digestion method were observed under an inverted microscope, and the cell number was counted. Morphology of nucleus pulposus cells was observed after hematoxylin-eosin staining and toluidine blue staining. Collagen type II immunoreactivity was detected by immunohistochemical s

10、taining combined with immunofluorescent staining. Nucleus pulposus cells were incubated in complete medium containing various glucose concentrations (0, 6.25, 12.5, 17.5, and 25 mmol/L) for 24 hours, and then cell proliferation and apoptosis were determined.RESULTS AND CONCLUSION: The stained nucleu

11、s pulposus cells showed polygonal and short spindle, with one or two nuclei. Cellular pseudopod appeared gradually and then became slim with increased passage numbers. The isolated and cultured nucleus pulposus cells positively expressed collagen type II and aggrecan Proliferative activity of nucleu

12、s pulposus cells cultured in medium with 17.5 mmol/L glucose was significantly higher than that in medium with 0 and 25 mmol/L glucose (P < 0.05 or P < 0.01). There was no significant difference in cell apoptosis between these groups except for 0 mmol/L glucose (P < 0.05). These results con

13、firm that a large number of nucleus pulposus cells can be harvested by trypsin plus type II collagenase digestion and the optimal glucose concentration is 17.5 mmol/L. Subject Headings: Tissue Engineering; Intervertebral Disk; Apoptosis; GlucoseFunding: the National Natural Science Foundation of Chi

14、na, No. 21472104Cite this article: Zhang CX, Ma JF, Wang DC. Trypsin plus type II collagenase digestion for isolation of nucleus pulposus cells: the optimal glucose concentration in complete medium. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(20):2899-2906.Zhang Cun-xin, Studying for masters degree, De

15、partment of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, ChinaCorresponding author: Wang De-chun, M.D., Professor, Department of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China2907ISSN 2095-434

16、4 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction椎间盘退变是脊柱退行性疾病的病理基础1，可引起多种与之相关的疾病，如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症和椎间盘源性腰痛等。影响椎间盘退变的因素众多，其中髓核细胞数量的减少及细胞外基质合成量下降及成分的改变被认为是影响椎间盘退变的主要因素2。因此，研究这些引起椎间盘退变的因素对预防和治疗脊柱退行性疾病具有重大意义3。椎间盘主要有髓核、纤维环以及上下的软骨终板构成。在髓核组织中，髓核细胞为主要细胞。它的细胞数量及活性，以及细胞外产物的合成对椎间盘功能和结构的维持具有重要意义。因此研究髓核细胞的生长特性及衰老、凋亡、

17、死亡机制，对研究椎间盘退变，乃至脊柱退行性疾病均具有重要意义。近年来，已经有关于通过细胞组织工程来治疗脊柱退行性疾病的报道4-5，目前也取得了相应的成果。然而，存在的问题是，髓核细胞体外分离、培养困难，而且髓核细胞属于非瘤性细胞，不能无限增殖，传代次数极为有限；传代后的细胞容易发生退变、衰老、凋亡及死亡，不能作为目的细胞继续研究。多项研究表明兔髓核细胞传代至第三四代之后，细胞的形态、生物学形状、生长活性以及相关蛋白的表达等均开始发生改变，不能作为种子细胞继续研究6。因此目前作为研究使用的髓核细胞大多是第1-3代的髓核细胞。关于髓核细胞体外培养技术也各持己见，有组织块贴壁法和酶消化法，也有两者相

18、结合的方法 等7。就酶消化法而言，有单纯采用型胶原酶消化 法8，也有采取胰酶联合型胶原酶消化法9，且每种方法中，消化酶的浓度及消化的作用时间也不相同。因此，最终收获的髓核细胞数量也差异较大。目前关于髓核细胞体外培养技术还在不断创新中。就原代培养时培养基的选择而言，可有多种选择，有商品化的完全培养基，也有实验人员自行配制的培养基等。培养基配方的多样化导致培养基中葡萄糖浓度也相差较大，例如：低糖型培养基中葡萄糖质量浓度小于1.0 g/L，而高糖型培养基中葡萄糖的质量浓度高达4.5 g/L。髓核细胞在体内生长于低氧、低糖、高压力的环境中，葡萄糖是其唯一的供能物质，因此培养基中葡萄糖是必不可少的成分。

19、髓核细胞能否像体内其他血供丰富的组织细胞那样适应外界培养基中的葡萄糖呢？已有研究表明，低糖或者高糖均会影响髓核细胞的生长和增殖10-11。但是培养基中葡萄糖浓度的差异是否会对髓核细胞的生长和增殖也产生影响？究竟哪种葡萄糖浓度的培养基最适宜兔髓核细胞的生长和增殖？目前还未见报道。实验旨在通过胰酶联合型胶原酶体外分离培养兔髓核细胞，并观察髓核细胞在不同葡萄糖浓度的培养基的生长活性、增殖效率及凋亡情况，确立适宜的体外分离培养兔髓核细胞的实验方法以及最适宜髓核细胞生长的培养基葡萄糖浓度，为完善髓核细胞体外分离培养的方法提供实验依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设

20、计 细胞对比观察性实验。1.2 时间及地点 于2015年4至9月在青岛大学附属医院中心实验时完成。1.3 材料 健康8周龄新西兰大白兔4只，雌雄不限，体质量1.0-1.5 kg，许可证号：SCXK(鲁)20120005，由山东青岛康大生物科技有限公司提供。实验过程中对动物进行的各种操作，均符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。1.4 实验方法1.4.1 髓核细胞的分离及培养 取8周龄新西兰大白兔，腹腔注射过量10%水合氯醛溶液10 mL/kg，麻醉成功后，耳缘静脉注射20 mL空气猝死。剪去背部毛发，碘伏消毒3遍

21、后，铺一次性无菌洞巾。沿棘突正中切口，依次切开皮肤及皮下筋膜，剥离椎旁肌，显露胸椎下段及全部腰椎。沿椎体两侧向前钝性分离，咬骨钳剪取胸椎下段及全部腰椎。将剪取下来的脊椎迅速转移至无菌工作台，无菌生理盐水冲洗血迹后，浸泡于PBS(含体积分数1%青-链霉素)溶液中。剪刀剔除椎体后方附件，尖刀片切开纤维环，无菌小刮匙轻轻刮下凝胶状髓核组织，置于含体积分数1%青链霉素PBS中。清洗3遍后，无菌眼科剪将髓核组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织碎块，转移至15 mL离心管后加入0.25%胰蛋白酶- EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司)，37 水浴锅中消化20 min，期间每5

22、 min摇匀1次。加入DMEM/F-12培养液(美国HyClone公司；含体积分数10%FBS)终止消化，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入型胶原酶(美国MP Biomedical公司)，置于37 水浴锅中消化60 min，待消化液变均一和浑浊后，加入DMEM/F-12培养液(含体积分数10%FBS)终止消化。200目不锈钢滤网过滤后，将过滤液转移至离心管，1 000 r/min，离心5 min，弃上清后加入适量DMEM/F-12培养液(含体积分数10%FBS、1%青链霉素)重新混悬。细胞计数板计数，调整细胞浓度为(3-5)×108 L-1后，接种到25 cm2培养

23、瓶中，每瓶接种5 mL。置于37 、体积分数5%CO2培养箱中培养。倒置显微镜观察细胞生长状态，接种后第4天首次半量换液，以后每隔三四天全量换液。待细胞汇合80%以后，胰酶消化传代。1.4.2 绘制细胞生长曲线 取第1-5代髓核细胞经0.25%胰蛋白酶胰消化后加入DMEM/F-12培养液，调整细胞浓度至1×108 L-1，分别接种在5个24孔培养板中培养，每孔加细胞悬液0.5 mL。每天从各培养板消化3孔细胞，混匀成等体积(1 mL)细胞悬液，用细胞计数板对细胞悬液计数，算出均值，以时间为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制细胞生长曲线。1.4.3 髓核细胞鉴定髓核细胞形态观察：取每代髓核

24、细胞在倒置显微镜下观察、拍照。髓核细胞苏木精-伊红染色：细胞贴壁牢固后，取出盖玻片，置于PBS中洗涤3次×2 min。40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次×2 min，苏木精染液(北京索莱宝科技有限公司)浸润10 min，体积分数1%盐酸乙醇分化60 s，PBS洗涤2次，伊红染液(北京索莱宝科技有限公司)浸润10 min，PBS洗涤2次，体积分数95%乙醇镜下分化至胞浆成粉红色，中性树胶封固，镜下观察、拍照。髓核细胞免疫组织化学染色：运用细胞免疫组织化学染色检测型胶原蛋白。细胞爬片PBS洗涤3次× 2 min。40 g/L多聚甲醛固定20 min，

25、PBS洗涤3次×2 min，然后用体积分数0.1%Triton X-100覆盖细胞浸润15 min，PBS洗涤3次×2 min。体积分数3%H2O2去离子水，室温孵育5 min，PBS洗涤3次×2 min。Collagen II Antibody (美国Novus公司；1200)，4 过夜，PBS洗涤3次× 2 min。PV-6002山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37 孵育20 min，PBS充分淋洗。加入适量的DAB显色工作液显色。镜下观察控制显色时间，当达到显色效果后，自来水轻轻冲洗终止显色，脱水、透明封固后倒置显微

26、镜下观察、拍照。髓核细胞免疫荧光染色：运用细胞免疫荧光染色检测型胶原蛋白。细胞爬片PBS洗涤3次×2 min。40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次×2 min，然后用0.1%Triton X-100覆盖细胞浸润15 min，PBS洗涤3次× 2 min。5%的DSA溶液，室温孵育30 min，PBS洗涤3次× 2 min。型胶原蛋白抗体(美国Novus公司)(1200)， 4 过夜，PBS洗涤3次×3 min。FITC标记山羊抗小鼠IgG (H+L)(北京索莱宝科技有限公司)37 避光孵育30 min后，DAPI(碧云天生物技术

27、研究所)室温避光孵育5 min，PBS洗涤5次×3 min。抗荧光淬灭封固剂封固后倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察并拍照。1.4.4 葡萄糖浓度筛选Cell Counting Kit-8检测细胞增殖：将生长良好、细胞浓度为80%的第2代髓核细胞，经0.25%胰蛋白酶胰消化后加入DMEM/F-12培养液，调整细胞浓度至5× 108 L-1，接种至96孔板，每孔100 L。共分5组，每组设8个复孔。当细胞汇合80%时，弃掉培养液，PBS洗涤2次×2 min，加入不含血清的培养液培养12 h后，弃掉培养液，PBS洗涤2次×2 min，每组加入葡萄

28、糖浓度依次为0，6.25，12.5，17.5(对照组)，25 mmol/L的细胞培养液。培养24 h后，按照Cell Counting Kit-8(北京索莱宝科技有限公司)使用说明书检测细胞增殖比率。 流式细胞仪检测细胞凋亡：取生长良好、汇合80%的第3代髓核细胞15瓶，随机分为5组，每组3瓶细胞。弃去培养液，PBS洗涤2次×2 min，加入不含血清的培养液培养12 h后，弃掉培养液，PBS洗涤2次×2 min，每组加入葡萄糖浓度依次为0，6.25，12.5，17.5(对照组)，25 mmol/L的细胞培养液。培养24 h后，按照凋亡检测试剂盒(北京嘉美生物公司)说明书处理

29、细胞后，检验各组细胞凋亡率。 1.5 主要观察指标 体外分离培养髓核细胞的形态特征以及在髓核细胞不同葡萄糖浓度培养液中的增殖及凋亡情况。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，两样本均数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 髓核细胞体外分离培养形态学观察及鉴定结果 胰蛋白酶联合型胶原酶消化分离髓核组织后，可收获较多髓核细胞。光学显微镜下观察发现髓核细胞从网状的纤维组织中释放出来。原代髓核细胞接种后倒置显微镜下观察可见细胞呈球形，大小不等，悬浮在培养液中，三四天后可见有细胞贴壁。细胞贴

30、壁后呈圆形并且变大，伸出伪足后呈三角形、多角形或短梭形，细胞核较大，有时可见双核，核仁明显，胞浆中可见分泌颗粒，细胞折光性好。培养约1周后，髓核细胞完全贴壁，细胞伸出的伪足相互连接成片。培养约15 d可见大部分细胞汇合，细胞周围可见基质样物质沉淀。培养约3周时，原代髓核细胞汇合可达85%以上。苏木精-伊红染色后，可见髓核细胞呈多角形、短梭形等不规则形状，胞核位于细胞中央或偏向一侧胞壁，染成蓝色，胞浆染成粉红色，越靠近胞核，胞浆着色越深。细胞免疫组化染色后可见胞质中型胶原蛋白染成黄褐色，越靠近细胞核着色越深。免疫荧光染色可见型胶原蛋白呈绿色荧光，大部分位于胞质中，且靠近胞核处荧光强度越强，胞核呈

31、蓝色荧光。见图1。2.2 髓核细胞生长曲线变化 通过对1-5代髓核细胞计数观察发现，细胞呈“S”型曲线生长，见图2。传代后第1天，细胞生长缓慢，从第2-4天细胞生长迅速，第五天细胞生长进入停滞期，以后细胞生长更为缓慢，几乎不再增殖。且随着细胞传代次数的增加，细胞的生长活性逐渐降低。经观察发现，第1-3代细胞生长活性较强，细胞形态相对维持不变。第4代髓核细胞开始发生退变，属于过渡阶段。第5代之后，细胞生长增殖能力显著减退，细胞形态发生变化，由多角形、短梭形逐渐变成长梭形。 2.3 葡萄糖浓度筛选结果 与17.5 mmol/L组相比， 25 mmol/L组细胞增殖受抑制(P < 0.05)；

32、6.25， 12.5 mmol/L组细胞增殖比率与对照组(17.5 mmol/L)相比差异无显著性意义；0 mmol/L组细胞增殖受抑制显著(P < 0.01)，见图3。与对照组(17.5 mmol/L)比较，当培养液中葡萄糖浓度为6.25，12.5，25 mmol/L时，细胞凋亡差异无显著性意义(P > 0.05)，当培养液中葡萄糖浓度0 mmol/L时，细胞凋亡率明显增加(P < 0.05)。见图4。3 讨论 Discussion随着中国逐渐步入老龄化社会，一些退变性疾病成为影响中国居民健康状况的主要疾病。一项研究表明，高达80%以上的人经历过各种不同程度的腰痛12。在这

33、些不同原因导致的腰痛中，因椎间盘退变所导致的腰痛占主要地位。目前很多研究表明，椎间盘退变同脊柱退行性疾病之间存在正相关关系13-15。因此研究椎间盘退变的因素对预防和治疗脊柱退行性疾病具有重大意义16。髓核细胞作为椎间盘内的主要细胞，其细胞数量及活性，以及细胞外产物的合成对椎间盘功能和结构的维持具有重要意义17。因此研究髓核细胞的生长特性及衰老、死亡机制，对研究椎间盘退变，乃至脊柱退行性疾病均具有重要意义18-20。近年来，已经有关于通过细胞组织工程来治疗脊柱退行性疾病的报道。研究髓核细胞退变的基础是体外培养大量髓核细胞用于研究。然而髓核细胞体外分离培养困难，且分离培养出来的髓核细胞随着传代次

34、数的增加，极易发生退变乃至凋亡21，不能作为种子细胞继续用于研究。因此，快速、高效的获得大量体外培养的髓核细胞，是该类研究的基础。实验成功实现了兔髓核细胞的体外培养。胰蛋白酶联合型胶原酶消化分离髓核组织后，不仅可以收获较多髓核细胞，而且可以缩短消化时间。0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37 水浴锅中消化20 min后，0.2%型胶原酶37 水浴锅中消化60 min，镜下观察即可见髓核细胞从网状的髓核组织中释放出来，这要比一些文献中型胶原酶4 消化过夜节省很多时间9。原代髓核细胞接种后倒置显微镜下观察可见细胞呈球形，体积大小不等，悬浮在培养液中，三四天后可见有细胞贴壁，细胞贴壁后呈圆形并且变

35、大，伸出伪足后呈三角形、多角形或短梭形，细胞核较大，有时可见双核，核仁明显，胞浆中可见分泌颗粒，细胞折光性好。培养约1周后，髓核细胞完全贴壁，细胞伸出的伪足相互连接成片。培养15 d可见大部分细胞汇合，细胞周围可见基质样物质沉淀。培养约3周时，原代髓核细胞汇合可达85%以上。这也和前人培养的兔髓核细胞生长特性相一致。虽然髓核细胞的鉴定方法多种多样，由于髓核组织中细胞成分比较单一，因此大家公认取材于髓核组织，且能稳定表达型胶原和/或聚集蛋白多糖的细胞默认为髓核细胞22。本次实验体外分离培养的细胞，经细胞免疫组化染色后可见胞质中型胶原蛋白染成黄褐色，越靠近细胞核着色越深。免疫荧光染色可见型胶原蛋白

36、呈绿色荧光，大部分位于胞质中，且靠近胞核处荧光强度越强，胞核呈蓝色荧光。因此，可以确定本次体外分离培养的细胞就是髓核细胞。体外分离培养的髓核细胞呈“S”型曲线生长。传代后第1天，细胞生长缓慢，从第2-4天细胞生长迅速，第5天细胞生长进入停滞期，以后细胞生长更为缓慢，几乎不再增殖。接种后前4天由于培养基中营养成分充足，细胞释放的代谢产物积累较少且细胞生存空间充足，因此，细胞分裂增殖较快。第5天后，随着细胞的增殖、积累，细胞生长空间骤减，加之培养基中营养物质消耗及细胞有毒代谢产物增加，所以细胞分裂、增殖速度减缓，以至于后期细胞基本维持数量不变，甚至较少。随着细胞传代次数的增加，细胞的生长活性逐渐降

37、低。实验观察发现，第1-3代细胞生长活性较强，细胞形态相对维持不变；第4代髓核细胞开始发生退变，属于一个过渡阶段；第5代后，细胞生长增殖能力显著减退，细胞形态发生变化，由多角形、短梭形逐渐变成长梭形，这与前人的研究相一致23。髓核细胞属于非瘤性细胞，其自身不可以无限分裂、传代，加之体外培养条件明显不同于体内条件，因此，体外培养的髓核细胞容易发生退变。主要表现在细胞活性降低，合成和分泌一些蛋白的能力下降。这和椎间盘内髓核细胞退变的过程基本一致24。实验发现，对照组培养基中葡萄糖浓度(17.5 mmol/L)，比较适宜髓核细胞生长。目前关于髓核细胞的体外分离培养方法各持己见7，25-26，缺乏一种

38、比较统一、可靠的培养的方法。就培养基的选择而言，就有多种选择。常见的培养基有DMEM-低糖型、DMEM-高糖型、DMEM-F12、NPCM和HNPC等，每种培养基葡萄糖的质量浓度，从DMEM-低糖型的低于1.0 g/L跨度到DMEM-高糖型的4.5 g/L。然而各种培养基均被采用体外分离培养髓核细胞，且均获得了成功，但哪种培养基的糖浓度最适宜髓核细胞生长，还未见报道。实验中，分别使用不同葡萄糖浓度的培养基培养髓核细胞24 h后，发现除6.25，12.5 mmol/L组外，其他各组细胞增殖比率均与对照组有显著差异，在各组中又以对照组(17.5 mmol/L)最高。这表明对照组的葡萄糖浓度比较适宜

39、髓核细胞的生长增殖，这表明轻度的低糖培养基，也是适宜髓核细胞生长的。但选用DMEM-高糖型培养基时，细胞增殖同对照组相比差异有显著性意义。众所周知，椎间盘为人体最大的无血供组织，其获取营养物质主要通过软骨终板及纤维环途径27，在此两者中又以软骨终板途径占主导地位。血液中的营养物质及氧气，包括葡萄糖主要通过软骨终板上的微孔经渗透作用弥散至椎间盘内，因此椎间盘内的营养物质及氧气要远低于血液中的含量，所以，椎间盘内的髓核细胞长期生存于低氧、低糖的环境中。因此，当选用DMEM-高糖型培养基时，髓核细胞可能不能适应这种高浓度的葡萄糖，所以生长活力要比对照组偏低。另外，有研究表明，高糖可以通过细胞内的多元

40、醇通路和氧化应激，进而产生多种蛋白和活性氧抑制细胞的增殖活性28-29。实验结果显示，0 mmol/L组细胞增殖活性显著低于对照组。髓核细胞主要通过葡萄糖获取能量，当培养基中没有葡萄糖时，细胞缺乏能量，则不能进行蛋白合成、染色体复制等细胞分裂前的物质储备过程，所以细胞基本上处于静止状态，无分裂、增殖。此外，体外培养的细胞，其增殖活性还与培养基的质量有关，比如胎牛血清的质量和浓度，必须氨基酸的添加，无机盐的种类、比例等因素相关。实验的流式细胞仪检测显示，0 mmol/L组细胞凋亡显著增加，正常培养的髓核细胞中也存在凋亡。体外分离培养细胞其基本原理就是模拟细胞在体内的生长环境，让细胞在体外继续生长

41、、增殖，但体外模拟的环境毕竟不能等同于细胞在体内的生长环境，包括细胞因子、激素、小分子营养物质等均不可能做到与体内一致。因此，体外的模拟环境必定会对细胞的正常生长造成一定的影响，所以即便是对照组正常培养的髓核细胞，也存在凋亡。由细胞增殖检测结果可知，当培养基中葡萄糖浓度为6.25，12.5 mmol/L时，髓核细胞增殖活性与对照组相一致。此时的葡萄糖浓度是适宜髓核细胞生长、增殖的，因此其凋亡率和17.5 mmol/L组无明显差异。在 25 mmol/L组，细胞增殖活性较17.5 mmol/L组偏低，但细胞凋亡与对照组比较无意义。这可能是因为这种浓度的葡萄糖浓度虽然不是最佳的浓度，但还不至于引起

42、髓核细胞大量凋亡。一些研究表明，当葡萄糖浓度达到一定程度，培养24 h后可见髓核细胞有明显凋亡30-31。另外，从细胞启动凋亡程序到细胞凋亡也需要一定时间32-33，也可能是此次培养时间过短，诱导因素作用轻度偏低，凋亡细胞的积累数量偏少，导致细胞凋亡差异不明显；可能培养时间再沿长一段时间，比如培养时间延长至36，48，72 h等以后，细胞凋亡会出现显著差异。通过此次实验观察显示，体外培养的兔髓核细胞呈多角形、短梭形，第1-4代细胞生长良好，随着传代次数的增加，细胞增殖活性明显减低。传代后的髓核细胞大致经历潜伏期、对数生长期和停滞期。实验观察显示1-5代髓核细胞传代后第1天为潜伏期，细胞生长缓慢

43、，从第2天细胞进入对数生长期，此期细胞生长迅速，第5天细胞生长进入停滞期，以后细胞生长更为缓慢，几乎不再增殖。通过实验观察发现，培养基中葡萄糖的浓度会对细胞的生长产生影响，当葡萄糖浓度为17.5 mmol/L时细胞增殖活力最高、凋亡率最低。高糖型培养基虽然不会引起髓核细胞凋亡增加，但与对照组(17.5 mmol/L)比较其细胞增殖活性明显降低。因此，在同等质量的培养基中，选择葡萄糖浓度为6.25-17.50 mmol/L的培养基比较适宜髓核细胞生长，更有助于体外分离、培养髓核细胞，高于或者低于此浓度范围的培养基，均可能会对髓核细胞的生长产生一定影响。作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者。实验

44、实施为第一作者。实验评估为第二作者和通讯作者。资料收集为第一、二作者。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作

45、者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Tsuji T, Watanabe K, Hosogane N, et al. Risk factors of radiological adjacent disc degeneration with lumbar interbody fusion for degenerative spondylolisthesis. J Orthop Sci. 2015.2 Ma JF, Zang LN, Xi YM, et al. MiR-125a Rs12976445 Polymorphism is Associated with the

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47、posus cells图注：图中A为普通光学显微镜下可见髓核细胞呈多角形、短梭形等不规则形状，细胞周围可见基质样物质沉淀(×40)；B为经苏木精-伊红染色后，可见髓核细胞呈多角形、短梭形等不规则形状，胞核位于细胞中央或偏向一侧胞壁，染成蓝色，胞浆染成粉红色，越靠近胞核，胞浆着色越深(×100)；C为细胞免疫组化染色后可见胞质中型胶原蛋白染成黄褐色(箭头所示)，越靠近细胞核着色越深(×200)；D为免疫荧光染色可见型胶原蛋白呈绿色荧光(箭头所示)，大部分位于胞质中，且靠近胞核处荧光强度越强，胞核呈蓝色荧光(×100)。图2 兔髓核细胞生长曲线Figure

48、2 Growth curve of nucleus pulposus cells图注：第1-3代细胞生长活性较强；第4代髓核细胞开始发生退变，属于一个过渡阶段；第5代之后，细胞生长增殖能力显著减退。65432101 2 3 4 5 6 7 8 细胞数量(1×105)第1代第2代第3代第4代第5代1.51.00.50图3 各组髓核细胞增殖比率变化Figure 3 Proliferative rate of nucleus pulposus cells图注：与17.5 mmol/L组比较，aP < 0.01，bP < 0.05。1-5分别为17.5，0，6.25，12.5，2

49、5 mmol/L组。图4 各组髓核细胞凋亡检测结果Figure 4 Apoptosis of nucleus pulposus cells图注：图A，B为0 mmol/L组细胞凋亡率较17.5 mmol/L组显著增高，而其他组与17.5 mmol/L组比较差异不明显。与17.5 mmol/L组比较，aP < 0.05。1-5分别为17.5，0，6.25，12.5，25 mmol/L组。1086420细胞凋亡率(%)时间(d)1 2 3 4 5细胞增殖比率1 2 3 4 5Annexin V 0 mmol/L组Annexin V 6.25 mmol/L组Annexin V 12.5 mmo

50、l/L组Annexin V 25 mmol/L组Annexin V 17.5 mmol/L组ABaba4 Watanabe T, Sakai D, Yamamoto Y, et al. Human nucleus pulposus cells significantly enhanced biological properties in a coculture system with direct cell-to-cell contact with autologous mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2010;28(5):623-630.5 Erw

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