PCR扩增产物的分析

1、pcr pcr 扩增产物的分析扩增产物的分析 gel electrophoresis restriction endonuclease molecular hybridization nucleic acid sequencepcrpcr扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析可用于科研及检测分析琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定

2、核酸的方法用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于下维持液体状态约数小时，主要用于dna片段片段的回收，质粒与外源性的回收，质粒与外源性dna的快速连接等的快速连接等凝胶浓度选择琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)线型线型dna分子的分离范围分子的分离范围(kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50

3、.2312.00.12琼脂糖凝胶的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与dna分离范围分离范围电泳缓冲液电泳缓冲液 常用三种缓冲液常用三种缓冲液 tris-硼酸（硼酸（tbe） tris-乙酸（乙酸（tae） tris-磷酸（磷酸（tpe） tbe与与tpe：缓冲容量高，：缓冲容量高，dna分离效果分离效果好，但好，但tpe在在dna片段回收时含磷酸盐浓片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使度高，容易使dna沉淀沉淀 tae：缓冲容量低，但价格较便宜，因而：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用推荐选用tae。缓冲液中的。缓冲液中的 edta 可螯合可螯合二价阳离子，从而抑制二价阳离子，从而抑制dna酶的活性，防

4、酶的活性，防止止pcr扩增产物降解扩增产物降解1010tbetbe缓冲液的配制缓冲液的配制 配方配方 tris 108克克 edta 9.3克克 硼酸硼酸 55克克 h2o至至 1000ml ph应为应为8.08.2 临用时用水稀至临用时用水稀至0.5tbe（20倍稀释）倍稀释）核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂 指示剂：指示剂： 溴酚兰溴酚兰 二甲苯青二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性dna片段片段琼脂糖凝琼脂糖凝胶浓度胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1kb0.6kb0.2kb0.15k

5、b核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色，二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性电泳时，其迁移速率与双链线性dna大大致相当致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2kb1.6kb载样缓冲液载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液组成载样缓冲液 作用：作用： 增加样品密度，使其比重增加，以增加样品密度，使其比重增加，以确保确保dna均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使

6、加样操作更方便使样品呈色，使加样操作更方便核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭溴化乙锭银染色银染色核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，eb） 是一种荧光染料，是一种荧光染料，eb分子可嵌入核酸双链的碱分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的eb，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色1015min 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶eb

7、染色，肉眼可见核酸电泳带，其染色，肉眼可见核酸电泳带，其dna量一般量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察后再观察核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂 银染色：银染色液中的银离子银染色：银染色液中的银离子(ag+)可与核可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使使ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂

8、糖凝胶染色琼脂糖凝胶染色 灵敏度比灵敏度比eb高高200倍，但银染色后，倍，但银染色后，dna不不宜回收宜回收电泳电泳 电泳装置电泳装置 电泳仪电泳仪 电泳槽电泳槽 灌胶模具等灌胶模具等电泳仪电泳仪 普通电泳仪普通电泳仪 高压电泳仪高压电泳仪电泳槽电泳槽 水平平板水平平板 垂直平板垂直平板电泳方法电泳方法 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子水平桌面上，并架好梳子 根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般脂糖凝胶，一般 200400 bp 的的dna片段片段（可配制（可配制1.21.7%）电

9、泳方法电泳方法配制琼脂糖凝胶及配制琼脂糖凝胶及倒胶倒胶 0.5tbe电泳缓冲液电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至波炉内加热熔化，冷却至60(需要时可加需要时可加入入eb)，倒入电泳槽中，待凝固，倒入电泳槽中，待凝固 向电泳槽中倒入向电泳槽中倒入0.5 tbe，其量以没过胶，其量以没过胶面面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）有气泡，应除去）电泳方法电泳方法上样与通电上样与通电 在在dna样品中加入样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混体积的载样

10、缓冲液，混匀后，加入样品孔内匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记记dna样品由负极往正极泳动（靠近加样孔样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为的一端为负），电压为1 5v/cm（长度以（长度以两个电极之间的距离计算）两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，一般一般 200400bp 的的pcr产物产物50v电压，电泳电压，电泳2040min电泳方法电泳方法结果观察结果观察 紫外仪上观察电泳带及其位置紫外仪上观察电泳带及其位置 并与核酸分子量标准比较被扩增

11、产物的大小并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的的dna片段和片段和dna序列分析序列分析 其装载的样品量大，回收其装载的样品量大，回收dna纯度高，长纯度高，长度仅相差度仅相差0.2%（即（即500bp中的中的1bp）的核苷）的核苷酸分子即能分离酸分子即能分离聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体，在催化剂由丙烯酰胺单体，在催化剂temed（n，n，n，n一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚

12、丙烯酰胺链在交联剂，酰胺链在交联剂，n，n一亚甲双丙烯酰胺一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶形成凝胶 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的的浓度决定的不同浓度丙烯酰胺和不同浓度丙烯酰胺和dnadna有效分离范围有效分离范围 丙烯酰胺丙烯酰胺（%）有效分离范围有效分离范围（bp）溴酚兰溴酚兰*二甲苯青二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245材料材料 电泳仪器

13、：电泳仪器： 电泳仪电泳仪 垂直电泳槽及其附件垂直电泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺丙烯酰胺 丙烯酰胺，丙烯酰胺，29克克 n，n一亚甲基双丙烯酰胺，一亚甲基双丙烯酰胺，1克克 h2o，加至，加至100ml装于棕色瓶内，装于棕色瓶内，4可保存二个月可保存二个月材料材料 10%过硫酸铵过硫酸铵 过硫酰铵，过硫酰铵，1克，加水至克，加水至 10 ml4可保存一周，可保存一周，-20可保存一个月可保存一个月 1tbe电泳缓冲液电泳缓冲液 temed（四甲基乙烯基二胺）（四甲基乙烯基二胺）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 配胶：根据分离配胶：根据分离dna片段的大小及需凝胶片段的大小

14、及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出严而使聚丙烯酰胺液漏出 将装好的玻璃电泳板倾斜成将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角角 按表按表3配制所需配制所需%浓度凝胶的毫升数浓度凝胶的毫升数 加入加入temed后，立即混匀，缓缓倒入两玻后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 立即插入适当的梳子，

15、密切注意防止梳齿立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减角，可减少液体泄漏的机会少液体泄漏的机会 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入中，上紧，倒入0.1tbe缓冲缓冲液液聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚

16、合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后生不规则的表面，将导致以后dna电泳带型电泳带型不规则不规则 将将dna样品与适量的载样缓冲液混匀后，加样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡到样品孔内，加样时不要产生气泡聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 接好电极，电压为接好电极，电压为1-8v/cm，进行电泳，进行电泳 电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，浸入含浸入含0.5ug/ml

17、的溴化乙锭溶液中，的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗，紫外仪下观察结果后取出水洗，紫外仪下观察结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量以上量的的dna条带（要求更高的灵敏度，可用银条带（要求更高的灵敏度，可用银染）染）电泳结果分析电泳结果分析 dna marker dna 人工片段人工片段 100 bp ladder酶切分析酶切分析 根据根据pcr产物中限制性内切酶的位点，产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切用相应的酶进行酶切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基此法既能

18、进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究因分型，还能进行变异性研究分子杂交分子杂交 检测检测pcr产物特异性的有力证据产物特异性的有力证据 检测检测pcr 产物碱基突变的有效方法产物碱基突变的有效方法 主要的杂交主要的杂交 southern印迹杂交印迹杂交 斑点杂交斑点杂交southernsouthern印迹杂交：印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针）并作标记（探针） 与与 pcr 产物杂交产物杂交 此法既可作特异性鉴定，又可以提高此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测检测 pcr产物的灵敏度，还可知其分产物的灵敏度，还可知其分子

19、量及条带形状，主要用于科研子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：斑点杂交： 将将pcr 产物点在硝酸纤维素膜或尼产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上龙膜薄膜上 寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交 观察有无着色斑点观察有无着色斑点 主要用于主要用于 pcr产物特异性鉴定及变产物特异性鉴定及变异分析异分析rdb检测检测 - -地中海贫血突变基因地中海贫血突变基因-29（ag）-28（ ag）17（ at，aag tag）e （cd26 gag aag）ivs-i-1（ gt ）ivs-i-5（ gc）27-28（+c）41-42（-cttt）43（ gt ）71-72（+a或或+t）654（ ct）

20、微孔板夹心杂交法微孔板夹心杂交法 通过一固定于微孔板的捕获探针与通过一固定于微孔板的捕获探针与pcr产物产物的某一区域特异性杂交，使的某一区域特异性杂交，使pcr产物间接地产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果 该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，其特异性较一次杂交的检测法高其特异性较一次杂交的检测法高：nos（11014/cm2） n-羟化琥珀酰亚胺酯羟化

21、琥珀酰亚胺酯 -cccccccapture probe:：nh2detection probe:：biotin：nh2标记的探针标记的探针：biotin标记的探针标记的探针avidin-hrp 显色系统显色系统：nos基团基团微孔板夹心杂交法微孔板夹心杂交法 方法学评价方法学评价 敏感度：该法检测敏感度：该法检测hbv，敏感度达，敏感度达5个个hbv dna分子分子 敏感性和特异性与敏感性和特异性与 pcr 32p 探针的探针的southern杂交法相当杂交法相当 pcr微孔板夹心杂交法：操作简便、快速、微孔板夹心杂交法：操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类避免了同位素标记探

22、针的危害，显色反应类似于临床常规应用的似于临床常规应用的elisa微孔板直接杂交微孔板直接杂交 不是采用夹心法，而是直接将特异的探不是采用夹心法，而是直接将特异的探针固定于微孔板上，然后用生物素标记针固定于微孔板上，然后用生物素标记的的pcr产物与之杂交产物与之杂交 只进行一次杂交，方法简单，但特异性只进行一次杂交，方法简单，但特异性不高不高微孔板杂交的基本过程 dna的固定的固定 探针的杂交探针的杂交 酶联显色酶联显色dnadna的固定的固定 在一定盐浓度条件下，在一定盐浓度条件下，dna单链的一端可单链的一端可固定在微孔板上固定在微孔板上 不同来源的微孔板固定不同来源的微孔板固定dna时所

23、需盐浓度时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度（0.153.0mol/l nacl）来固定加热变性）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度交。显色后，判断合适的固定盐浓度dnadna的固定的固定 固定方法的选择必须使固定方法的选择必须使dna最大量的固定，最大量的固定，且不影响杂交且不影响杂交 用合适浓度的用合适浓度的 nacl 或（或（nh4）2so4 可达到可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。此目的。硫氰酸钠则无固定作用。 盐浓度合适时，盐浓度合适时，dna应为一端固定到微

24、孔应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使板上，而太低或太高浓度的盐可能使dna “平躺平躺”固定在孔内而影响杂交固定在孔内而影响杂交dnadna的固定的固定 mg2+虽有促进虽有促进dna固定的作用，但它固定的作用，但它可激活可激活dnase，所以，一般不用，所以，一般不用 被固定的被固定的dna应大于应大于300bp，否则影响，否则影响杂交结果。每孔可固定高达杂交结果。每孔可固定高达 200ng（624bp）的）的dna 盐浓度和固定量确定后，按下法固定盐浓度和固定量确定后，按下法固定dnadnadna的固定的固定 待固定待固定dna 100加热加热 5min 变性，并立变性，并

25、立即冷却，与合适的固定液混合后，加入微即冷却，与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内孔板的孔内 固定液：固定液：10mmol/l磷酸钠磷酸钠-10mmol/l edta，ph7.0，合适浓度的，合适浓度的nacl（与（与dna变性混合后，变性混合后，终浓度为最适固定浓度）终浓度为最适固定浓度） 用胶布封好，浸于用胶布封好，浸于37水浴水浴2h 用用pbs-0.05%tween20 漂洗漂洗3次次立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存杂交与显色杂交与显色 杂交杂交 可采用标准的杂交系统杂交可采用标准的杂交系统杂交 夹心杂交时，是将变性的夹心杂交时，是将变性的pcr产

26、物与检测探针产物与检测探针一并加入一并加入 杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短 显色显色 根据不同酶标，检测分子的不同来选择不同的根据不同酶标，检测分子的不同来选择不同的底物、终止剂和测定波长底物、终止剂和测定波长 颜色互补分析法（颜色互补分析法（a a） 利用三原色原理，当不同利用三原色原理，当不同dna片段（片段（a和和b）同时扩）同时扩增时，用引物增时，用引物5端修饰技术将不同引物用不同颜色荧端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（光素标记（a片段引物标记绿色的荧光素，片段引物标记绿色的荧光素，b标记红标记红色的罗丹明）色的罗丹明） 如果仅有一条片段被扩增，扩

27、增产物激发后，只有如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色）一种颜色（红色或绿色） 如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带 如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色绿互补色-黄色带黄色带 如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿互补的黄色条带互补的黄色条带颜色互补分析法颜色互补分析法 方法学评价方法学评价 该法简便、易于自动化该法简便、易于自动化 可用于检测基因（缺失、染色体转可用于检测基因（缺失、染色体转位）和病原微生物位）和病原微生物只判断产物的有无只判断产物的有无在检测多种基因实变、多种病原菌和在检测多种基因实变、多种病原菌和hla分型时，可用复合分型时，可用复合pcr。此时，。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的色的rox；蓝色的；蓝色的coum等）等）pcr-elisapcr-