旧版PFGE脉冲场电泳技术培训4CHEF故障排除0224

1、脉冲脉冲场电场电泳技泳技术术 （ （pfge） ） 培培训训王彤宇王彤宇 培培训训部部mar-2014for internal bio-rad use only!chef脉冲场电泳的故障排除pfge trouble shooting for internal bio-rad use only!排除 pfge 凝胶 故障 比较复杂，涉及到多种因素 : 实验室各自的技巧和技能 实验室环境和设备条件 试剂 水质 实验过程中意外的干扰和分心（一）（一） pfge技技术术故障排除的一般考故障排除的一般考虑虑因素因素for internal bio-rad use only!通通过过改正一些不好的改正一些

2、不好的实验实验操作操作 （ （习惯习惯） ） 能能够够帮助解决部分帮助解决部分 pfge 结结果不佳的困惑果不佳的困惑 精准地 称量和 定容（积） 计算精确 确认所有仪器设备处于良好的工作状态 检查试剂化学品不得有沉淀、变色、絮状、过期 采用正牌厂家的试剂耗材 整个实验过程中戴手套 确认玻璃器皿干净， 不得有清洁剂、脏物碎片等残留，因为这些因素可能会影响凝胶小块的制备、裂解，从而导致结果背景上出现 斑点，脏点 千万不要使用千万不要使用质质量差的塑料容器，量差的塑料容器， 除非你确保它能被洗干除非你确保它能被洗干净净 千万不要千万不要过过分加分加热琼热琼脂糖溶液脂糖溶液 配置酶混合液时要混合充分

3、 处理每种微生物实验时，采用合适的试剂、内切酶和电泳参数条件（一）（一） pfge技技术术故障排除的一般考故障排除的一般考虑虑因素因素for internal bio-rad use only!想一想，对照上次成功的实验，有哪些因素变化了？过程方面： 仪器设备 试剂耗材 人力因素考虑操作规程中的所有步骤，自检式提问是否故障源自于其中某一个环节？考虑和观察凝胶的每片区域，试图识别其中某个区域可能同失败的原因有关联要做到这些， 操作者必须对每一步骤的的目的很熟悉，以及对每一步错误的操作可能带来的潜在后果明晰（一）（一） pfge技技术术故障排除的一般考故障排除的一般考虑虑因素因素for inter

4、nal bio-rad use only!（二）（二） 模糊一片的条模糊一片的条带带 (fuzzy or smeary bands)smeary bands affecting samples alone or samples & standardfor internal bio-rad use only!分析：分析：这这是很典型的假象是很典型的假象造成造成原因原因是是 蛋白蛋白酶酶消化消化 或或 核酸内切核酸内切酶酶切割切割 不完全不完全 . 只有小胶只有小胶块块 的的外周外周边缘边缘接触到接触到酶酶，得到了消化，而中心区域的，得到了消化，而中心区域的样样品却未被品却未被处处理到位，

5、理到位，所以所以样样品品电电泳泳结结果象个果象个“ “盒子盒子” ” 改改进进建建议议： ：小胶小胶块块做薄点；做薄点；降低制作小胶降低制作小胶块块的的琼琼脂糖脂糖浓浓度度酶处酶处理理时间时间适当适当延延长长采用新采用新鲜酶试剂鲜酶试剂增加增加酶酶的的浓浓度度（二）（二） 类类似似现现象象 或或 称称为为 box shaped bandsfor internal bio-rad use only!（三）歪曲的条带（三）歪曲的条带 (distorted bands)小胶小胶块块放入放入样样品孔品孔时时没放均匀没放均匀稳稳妥。它妥。它们应该们应该填填满满梳孔的整个梳孔的整个宽宽度，胶度，胶块块上上

6、沿沿须须同大的同大的电电泳凝胶表面泳凝胶表面齐齐平。平。 “v” 形形 或者或者 “ check mark” 形的条形的条带带是由于小胶是由于小胶块块一端高出另一端而造一端高出另一端而造成的成的 小胶小胶块块放到梳放到梳齿齿上后，上后， 周周围围液体没吸干液体没吸干样样品孔在灌制凝胶或拔出梳子品孔在灌制凝胶或拔出梳子时时不小心扭曲不小心扭曲循循环泵环泵的流速太慢的流速太慢检查连检查连接管路有无扭接管路有无扭结结 或堵塞了出入口或堵塞了出入口.for internal bio-rad use only!（三）歪曲的条带（三）歪曲的条带 (distorted bands)现现象：象：液体液体样样品

7、加品加载载到梳孔中，到梳孔中， 如果出如果出现长现长方形方形宽阔宽阔条条带带或是或是【 形，形， 往往由于顶往往由于顶部的凝胶比底部冷却快的原因，所以条带会倾斜部的凝胶比底部冷却快的原因，所以条带会倾斜 liquid samples loaded to the top of the well produce a wide square band or doublet with sides (an open square shape). this is caused by the top of the gel being cooler than the bottom of the gel so

8、that the band runs at a slant.for internal bio-rad use only!（三）歪曲的条带（三）歪曲的条带 distorted bands微微歪曲的条微微歪曲的条带带- 电电极方面的极方面的问题问题for internal bio-rad use only!（三）歪曲的条带（三）歪曲的条带 distorted bands歪曲的条歪曲的条带带- 加加样样方面的方面的问题问题for internal bio-rad use only!（三）歪曲的条带（三）歪曲的条带 distorted bands歪曲的条歪曲的条带带- 汽泡的原因汽泡的原因 ?for

9、internal bio-rad use only!（四）四） 样品没有往下方向迁移样品没有往下方向迁移 samples not migrating down the gel样样品没有品没有进进入凝胶入凝胶:如果如果标标准准样样品迁移正常的品迁移正常的话话, 有可能有可能样样品在前品在前处处理理时时没有没有酶酶解完全解完全 电电极极问题问题 检测电检测电流，流，电线连电线连接，接，电电泳泳时电时电极上的气泡极上的气泡 ， ，转换电场转换电场方向方向时时样样品品虽虽然然进进入了凝胶，但在中途停了下来入了凝胶，但在中途停了下来 :琼琼脂糖脂糖类类型和型和浓浓度度 ?主机主机电电源参数有否源参数有否

10、变变化化 ? (比如比如, 输输入入电压值电压值， ，电电流流值值 ?)缓缓冲液冲液类类型和型和浓浓度度 ?检查电检查电路路连连接是否完好接是否完好.在在编编有多套固定参数模有多套固定参数模块块的方案中，的方案中，仪仪器器为为第第2套步套步骤骤自自设设的的电压值为电压值为0.6 v/cm. 用用户户注意需要注意需要为为第第 1 套和第套和第 2设设置置电压值电压值for internal bio-rad use only!（四）（四） 样品迁移方向错误样品迁移方向错误 samples migrate to the wrong direction原因可能是程序原因可能是程序错误错误，尤其在含有多

11、状，尤其在含有多状态态参数参数组组合的程序中出合的程序中出错错。因。因为为 multi-state 模式要求模式要求输输入与垂直方向的入与垂直方向的夹夹角，一角，一samples are not going in the correct direction in the chef mapper, the problem may be a programming error while in the multi-state mode. the multi-state mode will ask for an angle from the vertical, rather than the inc

12、luded angle. so, for example, the researcher mistakenly programs in 120 degrees, then the sample will run in the wrong direction at a 30 degree angle.for internal bio-rad use only!（四）（四） 样品迁移方向错误样品迁移方向错误 samples migrate to the wrong direction样样品条品条带带整体整体 偏向左偏向左侧侧或右或右侧侧， ， 可能的原因：可能的原因：电电极断裂极断裂broken

13、electrode or electrodes.某某对电对电极的极的电电位有差异位有差异电电泳槽的泳槽的电电子部分由子部分由问题问题，比如，在槽盖的，比如，在槽盖的电电插座上未插座上未连连接通，靠接通，靠这这部分通路部分通路连连接主机接主机电电源部分源部分建建议议测测量量电电极极对对的的电压电压/电电流流 （拆（拆、 、揭开揭开电电泳槽面泳槽面, 24对电线对电线） ）for internal bio-rad use only!（四）（四） 样品迁移方向错误样品迁移方向错误-条带倾斜条带倾斜for internal bio-rad use only!（四）（四） 样品迁移方向错误样品迁移方向错

14、误 samples migrate to the wrong directionfor internal bio-rad use only!top of gel (wells)bottom of gelladders（四）（四）样样品迁移方向品迁移方向错误错误 samples migrate to the wrong directionfor internal bio-rad use only!（四）（四）样样品迁移方向品迁移方向错误错误 samples migrate to the wrong direction样样品条品条带带整体整体 偏向左偏向左侧侧或右或右侧侧， ， 可能的原因：可能的

15、原因：有有时时缓缓冲液循冲液循环环回路有回路有问题问题， ，由于由于琼琼脂糖碎片堵塞引起循脂糖碎片堵塞引起循环问题环问题 建建议议凝胶放凝胶放稳稳在胶框架内，以免在胶框架内，以免电电泳是泳是飘飘移；移；使用使用仪仪器原配胶框，自制的框不能太厚而阻器原配胶框，自制的框不能太厚而阻挡电挡电流流使用使用 挡挡胶条，胶条，冲洗清冲洗清洁洁整个管路和接口整个管路和接口 for internal bio-rad use only!（四）四）样样品迁移方向品迁移方向错误错误 samples migrate to the wrong direction原因： 凝胶外围人为地加了阻碍物体， 造成缓冲液循环不畅、

16、波动，继而电场方向受影响for internal bio-rad use only!（四）（四）样样品迁移方向品迁移方向错误错误 samples migrate to the wrong direction样样品条品条带带向外歪斜，向外歪斜， 可能的原因：可能的原因：缓缓冲液量不冲液量不够够，没有盖没凝胶，没有盖没凝胶，梳孔使用梳孔使用时间长时间长了，了，产产生弯曲弧度，两生弯曲弧度，两侧侧由于由于琼琼脂糖碎片脂糖碎片堵塞引起循堵塞引起循环问题环问题 建建议议加入大加入大约约2.1-2.2 升升缓缓冲冲液；液；把梳把梳齿齿反反过过来安装在固定架上。来安装在固定架上。for internal b

17、io-rad use only!( (五五) ) 蛋白酶蛋白酶k k消化步骤不完全消化步骤不完全没加没加sarcosyl ( (十二烷基肌氨酸钠）十二烷基肌氨酸钠）for internal bio-rad use only!( (五五) )蛋白酶蛋白酶k k消化后没有充分洗胶块以去除碎片杂质消化后没有充分洗胶块以去除碎片杂质 same plugs washed 6x with tesmearing and incomplete restriction resulting from insufficient washing, 1st figure shows plugs washed 4 tim

18、es with te, 2nd shows plugs washed 6 times with te.plugs washed 4x with tefor internal bio-rad use only!问题问题: 不完全酶切反应会造成条带“重影”或称 “鬼影” ，可能的原因可能的原因:小胶块质量差 proteinase k 没有清洗去除干净dna 浓度过高内切酶浓度内切酶商品/ 酶切缓冲液 批次质量问题 内切酶商品/ 酶切缓冲液 过期酶切孵育时间或温度条件错误（六）（六） 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题 troubleshooting - restriction st

19、eps10 units20 units40 unitsincomplete digestion due to low enzyme concentration results in ghost bands. by increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achieved. ghost bandsfor internal bio-rad use only!10 units20 units40 unitsincomplete digestion due to low enzyme concentratio

20、n results in ghost bands. by increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achieved. ghost bands建建议议: 多用 te 洗 2 次 小胶块 确保体系中加入足够的酶- 增加酶单位 确认 dna 浓度没有过高，从第一步减少菌体液开始，或者切小点、薄点的小胶块（六）（六） 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题 troubleshooting - restriction stepscomplete digestion 建建议议: (continued)

21、: 配置酶切预混液的内切酶和缓冲液必须高质量-注意保存条件，不能使用过期的for internal bio-rad use only!酶孵育时间过长 (过夜），就出现了 “星晕状-star activity ）现象；同样的酶 （ascl)反应2小时，则没有* barany, f. (1988) gene 68, 149asciapaiasciapaisame plugs re-testedovernight incubation2 hour incubation（六）（六） 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题 troubleshooting - restriction step

22、sfor internal bio-rad use only!e. coli o26, blni其它其它酶酶切切问题问题: 有些菌株有些菌株dna 无法被无法被酶酶切，切， 是因是因为为它没有特它没有特异性异性酶识别酶识别位点或无法接触特异性位点没接位点或无法接触特异性位点没接触触。 这种现象往往是看到在凝胶上端（靠近梳孔） 聚集着dna 样品，而泳道中既无条带，也没拖尾建建议议: 用同用同样样的的酶酶消化另一胶消化另一胶块块，确，确认认并不是先前并不是先前的那的那块块有有问题问题，（如先前，（如先前实验时实验时忘忘记记加入加入酶酶， ， 或没有接触到或没有接触到酶酶反反应应液液 如果仍然看到

23、如此现象时，可以帮助确定该酶与菌株的适用性问题for e.coli o26 single band was confirmed to be a valid pattern（六）（六） 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题 troubleshooting - restriction stepsfor internal bio-rad use only!sfiinotilanes 2 4, 6 and 7 are smears caused by expired enzyme that did not cut dna. the same plugs cut with noti enz

24、yme yielded distinct bands, indicating that the plugs were fine and smears were due to using expired enzyme.s = standard提示提示: 如何判断不完全如何判断不完全酶酶切是由于切是由于酶酶或或buffer 质质量造成的量造成的 ？ 采用另一种采用另一种酶酶 （以前（以前实验实验成功成功验证过验证过）或同）或同样样品品种但不同批次的种但不同批次的酶酶 ， ， 对对同批同批样样品品进进行行酶酶切切测试测试 加入 牛血清白蛋白 (bsa) ，即使该酶的供应没有提及。因为在酶切过程中既能

25、够帮助酶保持稳定，又能够减少由于抑制剂存在造成酶失活和防止酶粘附在管壁上的活性（六）（六）限制性限制性核酸内切核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题 troubleshooting - restriction stepsfor internal bio-rad use only!without thioureawith thiourea（六）限制性核酸内切（六）限制性核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题依依赖赖于硫尿于硫尿处处理理 或或 无法分型的菌株无法分型的菌株tris-缓缓冲液在冲液在电电泳泳过过程中程中产产生的生的一些氧化物质，某些菌体本身在酸性缓冲液中容易降解，硫尿作硫尿作为为一种一种还还原原剂剂

26、能中和氧化物能中和氧化物质质，改善，改善条条带带分型或一片模糊拖尾分型或一片模糊拖尾现现象象用于用于对对某些某些难难以以进进行条行条带带分型的菌株适用。分型的菌株适用。the same plugs were used in both gels. lanes 3, 4, 6, 7, 8 and 9 are thiourea-dependent. for internal bio-rad use only!建建议议: 在凝胶中加上阳性在凝胶中加上阳性对对照照 用曾经验证过的， 依赖于硫尿帮助分型的菌株 dna 样品 小胶块. 用了这个阳性对照后， 证明 无法分型的原因同其它，如制胶块，试剂等无关。

27、只是系统中需要硫尿 如果dna质量不好, dna 将滞留在孔内，即使加入硫尿也无济于事. 加入 50m thiourea (i.e. 10mg/ml 母液取873ml) 直接加入到 (0.5x tbe)， 然后电泳. 只在少部分菌株分型中需要，并非常用 use only when needed (with known strains or suspected serotypes) and not routinely.小心小心: 硫尿是变性剂， 使用和丢弃时 格外小心，须按照有毒有害废品管理规范处理（六）限制性核酸内切（六）限制性核酸内切酶酶步步骤骤 问题问题依依赖赖于硫尿于硫尿处处理理 或或

28、无法分型的菌株无法分型的菌株for internal bio-rad use only!old culture48 hrs fresh culture18 hrspfge gel from fresh culture shows no smearing and all bands are distinct. lysed cells are present in 48 hour old cultures (same organism), characterized by smears on the pfge gel (blue arrow). potential problems: undue

29、stress to bacterial cells prior to casting the plug can cause cell lysis, leading to dna degradation and is characterized by “smearing” on the gel. recommendations:grow cultures on non-selective mediause fresh cultures grown for 14 18 hours at appropriate temperature and conditions do not let cultur

30、es sit at room temp for more than an hour before making cell suspensions do not store cultures at 4c before making cell suspensions do not use cultures grown for more than 18 hours (contain lysed cells)do not centrifuge or vortex cell suspensionsdo not leave bacterial cell suspensions at room temp f

31、or extended periods of time prior to casting plugs（七）（七） 起始的菌体悬液质量起始的菌体悬液质量 preparing cell suspensionfor internal bio-rad use only!（八）（八） 制作包埋菌体的小胶块步骤制作包埋菌体的小胶块步骤1%1.4%1.2%1.6% 1.8%ssswhen agarose is reheated, water evaporates and the agarose concentration increases, resulting in plugs that do not h

32、ave the expected agarose percentage. reheating the agarose 6 times increased the concentration from 1% to 2%.s = standard potential problems:agarose that is too hot may damage the cellsagarose thickens and solidifies as it cools, making pipetting difficult and leading to an uneven distribution of ce

33、lls within plugsrecommendations:equilibrate melted agarose to 50 54c and keep warm while casting plugs.limit mechanical force (pipetting) when mixing melted agarose with cell suspensions.do not re-use plug agarose more than 3 or 4 times. repeated heating results in loss of fluid and increases the agarose concentration.反复熔化包埋用反复熔化包埋用琼琼脂糖脂糖浓浓度增加度增加2.0%for internal bio-rad use only!exposure time: too short = difficulty visualizing faint, bottom bands too long = increased background, loss of distinction between closely migr