生理试验方法

1、试 验 方 法 王涛1.SOD（超氧化物歧化酶）：氮蓝四唑法（NBT）法称0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L，PH7.8），冰浴研磨，研磨后再加1.5ml缓冲液，倒入离心管中，再用2.5ml缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（04）离心20min（10500rpm），离心后冷藏保存。取型号相同的试管，试管中加50L上清液(2支对照试管中各加磷酸缓冲液50L)，分别加3ml反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应2030 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560nm下比色测定吸光度值

2、。·磷酸缓冲液配制法：A：（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g，蒸馏水定容至1000mlB：（0.2mol/L NaH2PO4溶液）：NaH2PO4·H2O 27.6g或NaH2PO4·2H2O31.21g，蒸馏水定容至1000ml0.1mol/L缓冲液配法A：x（ml）+B：y（ml）稀释至200ml；0.05mol/L稀释至400ml。 0.1 mol/Lx(ml)y(ml)PH0.05mol/Lx(ml)y(ml

3、)PH12.387.76.061.039.07.084.016.07.591.58.57.891.58.57.894.75.38.0·反应液：水：磷缓：Met：NBT：EDTA-Na2：FD（核黄素）5：30：6：6：6：6150ml反应液组成：水12.7ml+磷缓76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA-Na215.25ml+FD15.25ml 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：1.9399gMet用磷缓定容至100ml；750mol/L氮蓝四唑溶液：0.06133gNBT用磷缓定容至100ml，避光保存；100mol/L EDTANa2溶液：0.

4、03721g EDTANa2用磷缓定容至1000ml；20mol/L核黄素溶液：0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。·计算公式：以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为酶活性单位(U)SOD总活性（units·g-1FW）(（Ack-AE）*V)/(0.5*Ack*W*Vt)SOD比活力(units·mg-1Pr)= SOD总活性/蛋白质含量Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（4ml），ml；Vt为测定时样品用量，ml；W为测定时样品重量（0.5g）；蛋白质含量单位为mg/gFW。2.POD(过氧化物酶)：愈创木

5、酚法取上清液20L加入比色杯中（对照加20L磷缓），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。·反应液：0.1mol/L，PH6.0的磷缓50ml，加入愈创木酚28L，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30H2O219L存于冰箱中。·计算公式：POD总活性(OD470·min-1·g-1FW)（OD470*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.02ml;W=0.5g；t1min) POD比活力（OD470·min-1·g-1Pr）总活性/蛋白质浓度3.CAT（过氧化氢酶）：取

6、上清液100L加入比色杯中（对照加100L磷缓），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。·反应液：0.1mol/L，PH7.0磷缓20ml，加0.1mol/L H2O25ml（5.68ml，30H2O2定容至1000ml）。·计算公式：CAT总活性(OD240·min-1·g-1FW)（OD240*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) CAT比活力（OD240·min-1·g-1Pr）总活性/蛋白质浓度4.MDA（丙二醛）：取上清液1ml（对

7、照加1ml水），加2ml0.67TBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000rpm下离心20min，取上清液于600nm、532nm、450nm下比色。·0.67TBA：称0.67gTBA，加少量1mol/LNaOH溶液，再用10三氯乙酸定容至100ml。·计算公式：C MDA（mol/L）6.45（A532A 600）0.56A450（消除糖类物质的干扰作用）MDA (mol/gFW)=C*V/W=0.1548(A532A 600)0.01344 A450(V=0.012L;W=0.5g)5.可溶性蛋白：考马斯亮兰G-250

8、染色法取上清液20L（对照加20L水），加3ml考马斯亮兰，放置2min后，马上于595nm下比色。G-250：100mg溶于50ml，90的乙醇中，加入85（w/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温下可放置一个月。标准曲线：Ypro（g）143.45OD+3.6（生）或143.56OD+1.28（园） 蛋白质含量（mg/gFW）（3*Y*V）/5*1000*a*W（Y标线值g；V酶液总体积4ml；a0.02ml；W0.5g；3/5由于标线是5ml中的含量，而本试验为3ml；1000将g变mg）6.ASP（抗坏血酸过氧化物酶）：抗坏血酸过氧化物酶（APX）：0.2ml酶提取液+2.8m

9、lAPX反应液，290nm比色（10S/20S）。（E=2.8 mMcm-1）APX反应液：55 l 30% H2O2（1mM）+0.02359g ASA（0.25mM）+0.01994gEDTA-Na2（0.1mM），磷酸缓冲液（pH7.0）定容至500ml。取1.0g样品，加1ml提取液（磷酸缓冲液0.05mol/L，PH7.8；2mmol/LAsA；5mmol/LEDTA，现用现配），冰浴研磨，研磨后再加1ml提取液，倒入离心管中，再用2ml提取液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（04）离心20min（10000rpm）。取上清液100L加入比色杯中（对照加100L提取液），加3ml反

10、应液，马上读290nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。·反应液：50mmol/L磷缓，PH7.0；0.1mmol/LEDTA；0.1mmol/L H2O2，0.5 mmol/LAsA。·计算公式：ASP总活性(OD290·min-1·g-1FW)（OD290*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=1.0g) ASP比活力（OD290·min-1·g-1Pr）总活性/蛋白质浓度7脯氨酸：0.5g鲜样（或0.05g干样），加5ml磺基水杨酸，封口沸水浴10min，冷却，用滤纸漏斗过滤

11、，吸滤液2ml（对照吸蒸馏水2ml），加2ml冰乙酸，再加3ml酸性水合茚三酮显色液，沸水浴40min，冷却，加5ml甲苯，充分震荡，静置分层，取上层甲苯液于520nm下比色。·3%磺基水杨酸：6g定容至200ml；·2.5%酸性茚三酮显色液：（150ml用量）3.75g茚三酮+90ml冰乙酸+24ml磷酸+36ml蒸馏水（4下23日有效）·标准曲线：Y脯氨酸=21.594OD-0.0785·计算公式：脯氨酸（g/gFW或DW）=Y*V/a*W(Y由曲线查得；V提取液体积=5ml；a为测定时吸取的体积=2ml；W为样品重=0.5g)8.电导率：鲜样先用自

12、来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2次，用打孔器打取圆片，取0.5g，装入大试管中，加入20ml蒸馏水，抽气3次，每次20min，第一次抽气后取出摇动，室温保持34h，多次摇动，测电导率S1，封口沸水浴10min，冷却（可用冷水冲泡），平衡10min后测S2，同时测定蒸馏水S0。·计算公式：相对电导率（%）=100*（S1S0）/（S2S0）9.根系活力：根系去掉根尖和上部老根，取根0.40.5g，剪成2cm长的段，放入试管中，对照先加2ml，1mol/L的H2SO4，其余试管中加0.4%TTC和磷缓（1/15mol/L，PH7.0）等体积混合10ml，封口，放入37恒温箱中4h，取出，除对照

13、外，其余加2ml，1mol/L的H2SO4终止反应，放置15min后，取出根，吸干，再放回原试管，各试管中加10ml，95%乙醇，封口，提取24h至根变白，根据颜色稀释35倍后，于485nm下比色。·0.4%TTC：称TTC1g，溶于250ml水中。·1/15mol/L，PH7.0的缓冲液：A61ml+B39ml，稀释至300ml·1mol/L的H2SO4：先在烧杯中加约100ml水，再加浓硫酸11ml，冷却后定容至200ml。·计算公式：四氮唑还原强度（g/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022(h=4,W=0.40.5)10.

14、叶绿素称取叶片0.2g，加20ml，80的丙酮（80ml丙酮定容至100ml），封口，置于暗处2436h，至叶片发白，于663nm、646nm、470nm下比色（以80丙酮为对照）。公式：色素浓度Ca（mg/L）12.21D663-2.81D646Cb20.13 D646-5.03 D663Cx.c（1000D470-3.27Ca-104Cb）/229色素含量（mg/gFW）C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)11硝酸还原酶（活体法测定）【样品应先照光23小时后采】称取叶片0.5g，剪成0.5-1.0cm2小块，加入试管中，对照先加1ml30三氯乙酸溶液，然后再向各试管中加入

15、0.1mol/l KNO3溶液9ml，抽气1小时，置于25暗反应30min。然后向各试管中加入1ml30三氯乙酸溶液【待叶片变色后（黄）】吸上清液1ml于新试管中，加2ml 1的黄胺和2ml 0.02萘胺溶液。显色20min，540nm下比色。（吸光值不能大于2，否则应稀释再测）80个样的用量：0.1 mol/l，PH7.5的磷缓：A液420B液80水500，将KNO3 10.11 g溶于上述1000 ml磷缓中。1黄胺：称2.5克溶于62.5 ml浓HCL中，定容至250 ml。0.02N1萘乙二胺酸盐：称0.06克于300 ml水中。30三氯乙酸：称30克溶于100 ml水中。标准曲线：Y

16、 NO2 =8.7317OD-0.4178计算公式：NR 活性（NaNO2 ug/gFW.h）=Y .n/W. h ( n=10/2,h=0.5)12.自由水/束缚水含量测定取称量瓶n（每处理6个，3次重复）个，编号，分别称准重量，用0.5cm2左右的打孔器打取300片，分别随机放入称量瓶中（各50片），盖紧，准确称取各瓶重量，求出各瓶样品鲜重，将其中3瓶置烘箱中于105下10min杀死组织，再于80下烘至恒重，求出组织含水量（%）。将另外3个称量瓶各加入60%65%（重量百分浓度）蔗糖溶液5ml，再准确称量求出各瓶糖液重量，于暗处放置46 h，其间不时轻轻摇动。到预定时间后充分摇动，用折射仪

17、分别测定各瓶糖液浓度，同时测定原来的糖液浓度。·60%65%蔗糖溶液：6065g蔗糖，置烧杯中加蒸馏水4035g，使总重量为100g。·计算公式：自由水含量（%）=100*(G*(D1D2)/D2)/W(G为糖含量g；D1糖液原来浓度%；D2浸叶后糖液浓度%；W植物组织鲜重g)束缚水含量（%）=组织含水量（%）自由水量（%）13.GR谷胱甘肽还原酶:（基于NADPH的氧化作用而在340nm下吸光度减少来衡量）鲜样0.5g，加入4ml50mmol/L的Tris-HCl（7.0），内含20（V/V）甘油，1mmol/LAsA，1mmol/LDTT，1mmol/LEDTA, 1m

18、mol/LGSH及5mmol/LMgCl2，在冰上研磨后，提取液在4下，经过20000×g离心30min，上清液用来测定酶活性。取上清液100L加入比色杯中（对照加100LTris-HCl），加3ml反应液，马上读340nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。·反应液：50mmol/L的Tris-HCl（PH7.5），5mmol/LMgCl2，0.5mmol/LGSSG，0.2mmol/LNADPH，终体积为1.2ml·计算公式：GR总活性(OD290·min-1·g-1FW)（OD340*V）/(a*W*t

19、)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) GR比活力（OD340·min-1·g-1Pr）总活性/蛋白质浓度14.O2-超氧阴离子自由基：羟胺氧化法(王爱国等1990)称2g样品加3mL提取液研磨提取后,吸2mL提取液供测定,反应时间为20min,求每克鲜样每分钟产生O-2的速率.以上指标测定均重复3次.药品：磷酸缓冲液、Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4·H2O、Met、NBT、EDTA-Na2、FD、愈创木酚、30H2O2、TBA、NaOH、10三氯乙酸、考马斯亮兰、90的乙醇、85（w/v）磷酸、AsA、磺基水杨酸、冰乙酸、甲苯、茚三酮

20、、蒽酮、乙酸乙酯、H2SO4、TTC、蔗糖、甘油、DTT、GSH、 MgCl2、Tris-HCl、GSSG、NADPH15. 可溶性糖：蒽酮比色法0.3g鲜样加10ml蒸馏水，封口沸水浴30min，（2次），滤纸漏斗过滤入50ml容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ml，加蒸馏水1ml（对照加2ml蒸馏水），加蒽酮乙酸乙酯液0.5ml，加浓H2SO45ml，振荡，沸水浴1min，自然冷却，于630nm下比色。·蒽酮乙酸乙酯：称1g蒽酮溶于50ml乙酸乙酯中（贮于棕色瓶中，可放数星期，如有结晶，加热溶解）·标准曲线：Y糖(g)=322.58OD0.96774·计算公

21、式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106)(Y为标线糖量g；V提取液体积=50ml；a为测定时吸取的体积=1ml；n稀释倍数=6.5，W为样品重=0.3g)16 苯丙氨酸解氨酶（PAL)（1）酶液提取方法。参照李靖等的方法准确称取0.5g鲜样，液氮保存后放入低温冰箱存样。取样后加入5mlpH8.8的硼酸缓冲液（含有5mmol/L巯基乙醇和0.01g聚乙烯吡咯烷酮），冰浴中研磨，0-4下8000r/min离心15 min，。上清液用于测定PAL活性。（2）PAL活性测定方法。参照毛爱军等的方法反应液为1ml pH8.8 1硼酸缓冲液（含0.02mol/l的L -苯丙氨酸），加入1

22、 ml酶液，2ml蒸馏水，总体积为4ml。对照不加酶液，以1ml蒸馏水代替。反应液置恒温水浴30下反应30min，加0.2 ml6mol/L HCl终止反应，测290 nm波长下吸光值，以反应时间零作参比，以OD290变化0.01为一个酶活性单位（U），用U/(gFW·h)表示酶活性。PAL活性（OD290nmmin-1g-1.FW）=OD290nm×N/W×T×nN:酶液提取总体积ml W：样品鲜重g T：反应时间min n：反应体系中酶液体积ml pH8.8的硼酸缓冲液：取60ml溶液A和40ml溶液B用水稀释至200ml溶液A：0.2mol/L硼酸

23、（12.4g硼酸H3BO3用蒸馏水配成1000ml）溶液B：0.05mol/L硼砂（19.07g硼砂Na2B4O7.10H2O用蒸馏水配成1000ml）0.02mol/L苯丙氨酸硼酸缓冲液：每毫升pH8.8的硼酸缓冲液加0.0033038g L-苯丙氨酸17多酚氧化酶(PPO)药品 柠檬酸、磷酸氢二钠,邻苯二酚(儿茶酚)。所用药品均为国产分析纯。实验仪器 超低温冷冻冰箱,美国贝克曼公司(Backman.U.S.A.);电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;低速冷冻离心机(DL-5LM),湖南星科科学仪器有限公司;微量移液器(5005000l,1001000l),made in Germany

24、;紫外分光光度计2010型,日本日立公司。实验方法2.2.1待测酶液制备分别称取以上刺嫩芽样品各1g加入10ml pH 5.6柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液于冰水浴中快速研磨成匀浆,离心20min (44000r/min ),取上清夜即酶液,贮存于冰箱(4)中待测。2.2.2酶活力测定方法17在反应体系中加入0.5ml pH5.6柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液和1 ml 0.2mol/L邻苯二酚溶液作为底物倒入1cm比色杯中混匀,加入0.5 ml刺嫩芽待测酶液,迅速放入紫外分光光度计中于420 nm处进行时间扫描(以pH5.6柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液为空白),反应时间为4 min,每30s记录吸光度

25、值(OD值)。计算每分钟的OD值变化,即OD420nm。酶活力单位定义为:在一定温度、pH值条件下1mmol/L底物浓度每分钟改变0.01吸光度所需的酶量为1个酶活力单位。计算公式:多酚氧化酶活性:u/(g·min)=420×V/W×V×0.01×t其中,VT提取酶液总体积,10ml;W待测材料质量,1g;Vs测定时取用酶液体积, 0. 5ml;t反应时间变化,4min;D稀释倍数,4。求出酶活力的平均值,并利用公式计算出标准误差(SE):=(N1-N)2+(N2-N)2+(N3-N)22(N算术平均值;N1第1组样品的酶活力单位数;N2第2组

26、样品的酶活力单位数;N3第3组样品的酶活力单位数)。对所得数据进行t检验(n<30)。利用公式t0=xS/ n其中,x为样本的均数,为平均OD值;S为标准误差SE;n为自由度,为1。木质素的测定参照Sancho的半定量法。精确称取鲜重0.5g的材料于沸水中冲洗,液氮研磨后加去离子水（5ml）离心（8000g，15min，20）,以无水乙醇冲洗（2次）沉淀,将沉淀溶解（震荡）于5.0mL4%的HCl/乙醇溶液中2.5h,期间涡旋数次（加入后涡旋，以后每1小时涡旋一次，共3次）,加入100L含3%的间苯三酚的盐酸溶液（现配现用，避光）,30min后离心（同上）取上清,测定540nm处的吸光值

27、,以不加植物材料的反应液为空白,吸光值表示木质素类物质的含量。（测出的只是相对植，注意取材要一致）17 PPO活性测定 采用高俊凤的方法进行提取和测定 酶液的制备：每一重复准确称取0.5g黄瓜叶片，洗净，剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂（加少量PVP)，然后加入5ml0.05mol/LPH6.5的磷酸缓冲液冰浴中快速研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，在4下5000r/min离心10min。上清液定容到10ml，此为PPO粗酶液。 多酚氧化酶测定：反应体系包括0.05mol/lPH6.5的磷酸缓冲液1.5ml，0.1mol/l邻苯二酚1.5ml和酶液0.5ml以煮沸失活的酶液作对照，于37保

28、温10min，立即加入20%三氯乙酸溶液3ml终止反应，与525nm波长处理测定其吸光度。 A525×酶提取液总量（ml） 酶活力（0.1Ag-1min-1）                        0.1×反应时间（min）×样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml） 18 总酚和单宁含量测定 参照武予清迅速用冷冻

29、干燥机在-70下24h冻干,取出粉碎,过80目筛,将冻干粉置于-20下密封保存备用.准确称取样品冻干粉20mg,放入具塞试管中,然后在试管中加入70%甲醇5ml,封口摇匀,在室温下放置24h,然后用5000转·min-1离心10min,取上清液备测.总酚测定：Folin酚还原法：原理是碱性溶液中酚类化合物可在以将钨钼酸还原,生成蓝色的化合物.颜色的深浅与酚含量呈正相关, 在760nm处有最大吸收峰. 0.1mg/cm3 标准没食子酸溶液（称取标准没食子酸0.01g,定容到100ml）； 吸取待测液1一2ml（0.5），放入盛有70ml（8.9ml）蒸馏水的试管中，加入5ml （0.5

30、ml）F一D试剂和10ml（0.1ml）饱和Na2CO3溶液，总体积100ml（10ml）摇匀，半小时后立刻用分光光度计在760nm处进行比色测定。测定之前应先配制F一D试剂，饱和Na2CO3榕液、1%FeCl3溶液（用来校准提取完全的）和没食子酸标准液。F一D试剂的配制方法是:在750毫升蒸馏水中，加入钨酸钠100克、磷钼酸20克及浓磷酸50毫升，加热回流2小时，冷却后稀释至1000毫升。用同样条件，按上述方法，用蒸馏水作空白试验，以此校正仪器零点。又用同样条件作标准0.1mg/cm3 标准没食子酸溶液（称取标准没食子酸0.01g,定容到100ml）的工作曲线，标准曲线的制作：取12支干燥的

31、试管，分成2组，每组依次加入0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6cm3标准没食子酸溶液，用蒸馏水补足1ml，另取一支试管，加1ml蒸馏水作对照。按上述方法分别加入F一D试剂及饱和Na2CO3溶液，半小时后立刻用分光光度计在760nm处进行比色测定。测定吸收值(A)，以吸收值对没食子酸ppm数绘制工作曲线。从工作曲线土查出样品相应的没食子酸ppm数，依下式求出总酚含量。总酚% = T×100/W×(V1/V0) ×106 = (T×V0/W×V1)×10-4 (T一从工作曲线上查出相应的单宁酸PPm数;W一样品克数;V。一

32、提取液定容的毫升数;V;一用于比色的提取液毫升数)单宁测定：香草醛反应：应专门用于测定缩合单宁及其前体黄烷醇(如儿茶素等),但是与氧化程度较高的黄酮(如槲皮素及其糖苷)不发生反应,是从缩合单宁与黄酮类化合物的混合物中测定缩合单宁含量的较好方法.将4%香草醛的甲醇溶液3ml、浓盐酸1.5ml和0.5ml的待测提取液加入以铝箔遮光的试管中摇匀,放入20的水浴锅中水浴20min,然后在510nm处测定吸光度,标准样品为儿茶素(Fluka).19类黄酮含量的测定方法：精确称取烘干的样品002g，加入5ml50乙醇浸泡12h，在一定温度和超声频率下处理一定时间后趁热过滤。取1ml提取液，加4ml30乙醇

33、，然后加入5的亚硝酸钠0.3ml，摇匀放置5min，加10的硝酸铝0.3ml，放置6min，加1M的氢氧化钠4m1，再加0.4 30乙醇，共10ml。摇匀，放置10min后，以相应试剂作空白对照，在510nm下测定吸光值。标准样品为芦丁(中国药品生物制品检定所)。所确定的标准曲线：Y=14335X+00235，R2=09991，P<0001，式中，X为吸光度，Y为浓度(mg·ml-1)，线性范围：020mg·ml-1。·黄酮含量的测定方法取烘干的样品，用液氮将其研磨至粉末状，精确称取005g，加入5ml95乙醇后，在44下，超声60min。离心10min，室

34、温静置4h，进行样品提取液制备。其过程为：取25ml容量瓶，加4ml水，吸取样品提取液2ml，加入5的亚硝酸钠1ml，摇匀放置6min，加10的硝酸铝1ml，放置6min，加5的氢氧化钠l0m1，再加水定容至刻度，摇匀，放置15min后，以相应试剂作空白对照，在500nm下测定吸光值。根据标准曲线计算出提取液中黄酮的含量。标准样品为芦丁(中国药品生物制品检定所)。所确定的标准曲线：Y=14335X+00235，R=09991，P<0001，式中，为吸光度，】，为浓度(mg·ml)，线性范围：020mg·ml。20生物碱含量的测定方法:将风干的白屈菜样品粉碎过筛(40目

35、)，精密称取01g样品，加氯仿一乙醇(1：1)5ml，冷浸过夜后，用超声波仪超声30min，离心10min。取上清液4ml，氮气干，加4ml95乙醇与冰醋酸混合液(10ml中有5滴冰醋酸)复溶，超声10min。将025ml提取液定容至5m1。以相应试剂作空白对照，在350nm波长下测定吸光值。根据标准曲线计算出提取液中生物碱的含量。标准样品为盐酸小檗碱。所确定的标准曲线：Y=14684X一00038，R2=09998，P<0001，式中，X为吸光度，y为浓度(g·ml-1)，线性范围：20200g·ml-1。21 CHS CHS enzyme was extracte

36、d and assayed using HPLC byfollowing the method used by Zuurbier et al.(1993).One gram of frozen stem and leaf tissues were homo-genized using a pestle and mortar in 10%(w/w)poly-vinylpolypyrrolidone(PVPP)and 5 ml 0.1 M potassiumphosphate extraction buffer(pH 6.8)containing 14 mM b-mercaptoethanol,4

37、0 mM ascorbic acid,3 mM EDTA,10 mM leupeptin and 0.2 mM phenylmethylsulphonylfluoride.The homogenate was centrifuged at 11 700 gfor 20 min at 4?C to remove the cell debris.The resultingextract was precipitated with ammonium sulphate(70%(w/v)saturation),centrifuged at 11 700 g for 10 min at4?C.The pr

38、otein was desalted using PD10 column withPD10 buffer(0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8,1.4 mM b-mercaptoethanol,40 mM ascorbic acid and5%(w/v)trehalose).The eluent was used for CHS assayand determining the protein concentration.CHS activity was determined by measuring the amountof naringenin p

39、roduced.The CHS assay was performed at 37?C for 1 h in an assay mixture containing 50 ml protein extract(7 mg ml-1),50 ml assay buffer(0.5 M potassium phosphate pH 6.8,2.8 m M b-mercaptoeth-anol and 2%(w/v)(BSA),5 ml 0.4 mM malonyl CoA(2nmol)and 5 ml 0.2 mM p-coumaroyl CoA(1 nmol).At the end of the

40、incubation period 200 ml degassed EtOAc(ethyl acetate)was added,mixed by vortexing and cen-trifuged at 11 700 g for 5 min.The EtOAc layer was transferred into an Eppendorf tube and evaporated to dryness using a vacuum concentrator.The residue was then dissolved in 20 ml MeOH and analysed by HPLC.The

41、 HPLC system used consisted of an LKB model 2150 HPLC pump,an LKB model 2151 variable wave-length monitor and chromatographic data processor.A guard column packed with octadecyl silica十八烷基硅(30 mm par-ticle size),a 5-m Rosil reverse-phase C18 separation column(Beckmann,250×4.6 mm id)were used.The eluent consisted of MeOH-H2O-85%H3PO4(280:136:1),pH 2.6 and a flow rate of 1 mlm-1 was used with pressure,230 bar.The amount of naringenin produced was analysed by HPLC using the height of the naringenin peak at 290 nm.高性能液体色谱系统包括了LKB模型2150高性能液体色谱泵、LKB模型2151易变的波