烟草中三种农药的测定方法(修改稿)

1、权利要求书1、一种烟草及烟草制品中三种酰胺类除草剂的高效液相色谱-串联质谱的测定方法，即甲草胺、异丙甲草胺和敌草胺三种除草剂，其特征在于：该方法是通过基质分散固相萃取法萃取除草剂农药残留，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中的农药残留量，具体方法如下：a、样品的提取：准确称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润；静置10 min后移取10 mL乙腈和50 mL内标（氯唑磷，20 mg/mL）至离心管中，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡1 min。将离心管置于0 条件下保持10 min，然后向离

2、心管中加入Agilent SampliQ QuEChERS EN萃取试剂盒，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡2 min，然后以4000 rpm速率离心10 min；b、样品净化：移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，加入Agilent QuEChERS 2 mL 分散固相萃取试剂盒，于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000 rpm 速率离心2 min；吸取上清液经0.22 mm有机相滤膜过滤，移取200 mL，用乙腈稀释至1.0 mL，用LC-MS/MS检测；c、内标溶液的配制：用氯唑磷做内标，配制氯唑磷浓度约为20 mg/mL的甲醇溶液；d

3、、基质混合标准工作溶液制备：配制具有浓度梯度的且含有内标的基质混合标准工作溶液； e、液相色谱-串联质谱测定:吸取以上配制好的不同浓度的基质混合标准工作溶液，注入液相色谱-串联质谱仪；f、农药残留量测定结果的计算以内标法进行残留量的定量分析，即以农药和内标的定量离子对峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999,对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的各种农药的残留量。2、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：标准工作溶液制备具体如下：分别称取10 mg三种农药标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度

4、，配制成每种农药的单一标准储备液；移取一定量各农药的单一标准储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合标准储备液；分别移取混合标准储备液25 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL , 500 mL 及1000 mL到6个10 mL容量瓶中，并加入50 mL内标（氯唑磷，20 mg/mL） 用乙腈定容，制得标准工作溶液；然后分别移取上述标准工作溶液200 mL与200 mL的空白样品提取溶液混合，并用乙腈稀释至1.0 mL，配制成基质混合标准工作溶液。3、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：标准工作溶液制备具体如下：采用的液相色谱条件为：色谱柱：Atiantis

5、dC18 (150 mm×2.1 mm，3 mm, 美国Waters公司)；流动相：乙腈-水（0.1 %甲酸)，梯度洗脱；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ；进样量：10 mL；采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 雾化气流量为60 psi; 气帘气流量18 psi; 辅助加热气流量为60 psi; 离子化温度500 ; 碰撞气流量为10 psi; 4种气体均为氮气; 停留时间为100 msec; 电离电压5500 V, MRM模式采集。说 明 书 摘 要本发明涉及一种烟草及烟草制品中三种酰胺类除草剂的高效液相色谱-串联质谱的测定方法，即甲草胺、异丙

6、甲草胺和敌草胺三种除草剂，属于烟草及烟草制品中农药残留的理化检验技术领域，其特征在于：该方法是通过基质分散固相萃取法萃取农药残留，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中农药残留量的方法。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：本发明方法样品前处理过程简单、快速，可减少烟草中色素等杂质的干扰,并具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。8说明书烟草及烟草制品中三种酰胺类除草剂的高效液相色谱-串联质谱的测定方法技术领域本发明属于烟草及烟草制品中农药残留的理化检验技术领域，主要涉及烟草及烟草制品中酰胺

7、类除草剂残留量的测定技术，具体说是用乙腈对样品进行浸提，再加入无水硫酸镁与氯化钠等振荡促使其分层，随后进行分散固相萃取，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中三种酰胺类除草剂残留量的方法。背景技术酰胺类除草剂是 20世纪 60年代开发的一类高效、高选择性的触杀型除草剂。它对多种禾本科双子叶植物具有强烈的杀毒作用, 主要用于防除一年生禾本科杂草幼芽。大鼠体内试验表明, 酰胺类除草剂可进一步转化成有致癌作用的二烷基醌亚胺, 因此其残留情况受到广泛关注。文献报道有关此类除草剂残留检测分析较多, 主要有气相色谱-氮磷检测器(GC-NPD)法、气相色谱-电子捕获检测器 (GC-ECD)法、气相色谱

8、-质谱法、高效液相色谱法等。YC/T 179-2004【中华人民共和国烟草行业标准YC/T 179-2004 烟草及烟草制品 酰胺类除草剂农药残留量的测定】使用 GC-NPD检测, 目前 NPD是检测氮磷化合物灵敏度较高的检测器, 而 NPD对含氮化合物的响应与其分子结构有关, 对胺类特别是酰胺类响应小。烟叶含氮物质极多, 很难完全净化干净, 容易造成假阳性。而且 NPD存在随使用时间增长性能变差的缺点, 影响检测的准确性。师君丽等【分析实验室，烟草中酰胺类除草剂残留的GC-MS检测，29增刊：2010，5】将烟草样品用乙腈提取，弗罗里硅土固相萃取柱净化，然后利用GC-MS检测了烟草中的异丙甲

9、草胺、草乃敌和敌草胺三种除草剂。但是该方法需要消耗大量溶剂，而且该方法操作繁琐，费时。LC-MS/MS具有较高的灵敏度和较强的专属性，不需要使分析物之间实现完全的色谱分离，使得样品预处理过程简化，同时分析测试时间大为缩短。可以实现对多类型多残留的同时分析。发明内容：本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用基质分散固相萃取-液相色谱-串联质谱测定烟草及烟草制品中酰胺类除草剂残留量的测定方法，该方法能快速、准确检测烟草及烟草制品中酰胺类除草剂残留量，测定结果准确、测定干扰少。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：烟草及烟草制品中三种酰胺类（即甲草胺、异丙甲草胺和敌草胺）除草剂的高效液相色谱

10、-串联质谱的测定方法，是通过基质分散固相萃取法萃取除草剂农药残留，以液相色谱-串联质谱直接测定烟草及烟草制品中的农药残留量，具体方法如下：a、样品的提取：准确称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润。静置10 min后移取10 mL乙腈和50 mL内标（氯唑磷，20 mg/mL）至离心管中，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡1 min。将离心管置于0 条件下保持10 min，然后向离心管中加入Agilent SampliQ QuEChERS EN萃取试剂盒(Agilent 5982-5650)，立即于漩

11、涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡2 min，然后以4000 rpm速率离心10 min；b、样品净化：移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，加入Agilent QuEChERS 2 mL 分散固相萃取试剂盒（Agilent 5982-5321），于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000 rpm 速率离心2 min。吸取上清液经0.22 mm有机相滤膜过滤，移取200 mL，用乙腈稀释至1.0 mL，用LC-MS/MS检测；c、内标溶液的配制：由于氯唑磷已不在烟草中使用了,所以用氯唑磷做内标。配制氯唑磷浓度约为20 mg/mL的甲醇溶液；d、基质混合标

12、准工作溶液制备：配制具有浓度梯度的且含有内标的基质混合标准工作溶液； e、液相色谱-串联质谱测定:吸取以上配制好的不同浓度的基质混合标准工作溶液，注入液相色谱-串联质谱仪；f、农药残留量测定结果的计算以内标法进行残留量的定量分析，即以农药和内标的定量离子对峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999,对提取后的样品进行测定，测得检出农药和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的各种农药的残留量。本发明基质混合标准工作溶液的配制方式如下：分别称取10 mg三种农药标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成每种农药的单一标准储备液；移取一定

13、量各农药的单一标准储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合标准储备液；分别移取混合标准储备液25 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL , 500 mL 及1000 mL到6个10 mL容量瓶中，并加入50 mL内标（氯唑磷，20 mg/mL） 用乙腈定容，制得标准工作溶液；然后分别移取上述标准工作溶液200 mL与200 mL的空白样品提取溶液混合，并用乙腈稀释至1.0 mL，配制成基质混合标准工作溶液。在液质联用测定时，采用的液相色谱条件为：色谱柱：Atiantis dC18 (150 mm×2.1 mm，3 mm, 美国Waters公司)；流动相：乙

14、腈-水（0.1 %甲酸)，梯度洗脱程序表见表1；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ；进样量：10 mL；采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 雾化气流量为60 psi; 气帘气流量18 psi; 辅助加热气流量为60 psi; 离子化温度500 ; 碰撞气流量为10 psi; 4种气体均为氮气; 停留时间为100 msec; 电离电压5500 V, MRM模式采集，MRM参数见表2。表1 流动相梯度洗脱条件时间/ min流速/ (mL/min)水(0.1%甲酸)/ %乙腈/ %0.0020050502.00200208010.00200208011.00200

15、505020.002005050表2 三种除草剂及内标物质监测离子对、去簇电压及碰撞能量序号中文名称英文名称定量离子定性离子去簇电压(V)碰撞能量(V)1甲草胺Alachlor270.3/238.1270.3/162.470；7015；252异丙甲草胺metolachlor283.3/252.3283.3/176.470;7020;353敌草胺napropamide272.1/129.1272.1/199.275;7522;20内标氯唑磷Isazophos314.0 /120.0 314.0 /162.1 37;3722.5;22本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样品优化了

16、样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：本发明方法样品前处理过程简单，大大缩短了每个烟草样品的萃取前处理时间。本发明方法将烟末用乙腈进行浸提，再加无水硫酸镁、氯化钠等促使其分层，最后取萃取液进行分散固相萃取。该方法提高萃取效率，又能对烟草中的色素及烟草植物组织的其他共萃物（脂肪酸、叶绿素等）起到较好的吸附净化作用，避免了样品浓缩、净化、衍生等过程造成的待测农药组分损失，又使实验操作更加简单、快捷。（2）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。 本发明方法的检测限：将不同浓度的农药混合标准工作溶液注入LC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检

17、测限（LOD），检测限在0.002 mg/g-0.005 mg/g之间。 本发明方法的重复性和加标回收率：在烟草样品中加入混合农药的标准溶液，然后进行前处理和LCMS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表3。由表3可以看出，各种除草剂的回收率均大于95%，平均相对标准偏差（RSD）小于6.0%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。表3 三种除草剂的回收率和重复性（n=5）序号中文名称英文名称保留时间（min）相关系数LOD(µg/g)回收率(%)RSD (%)1甲草胺Alachlor7.010.99980.00299.61.32异丙甲草胺metolachlor12.4

18、50.99510.00498.52.93敌草胺napropamide15.210.99960.005101.35.2附图说明图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。具体实施方式本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。实例1：1仪器与试剂：三种农药均为标准品；乙腈、甲酸均为农残级。API 4000四极杆串联质谱仪；涡旋振荡仪(美国Labnet公司)；Sigma 3-30K离心机(德国Sigma公司)；AE 163电子天平（感量：0.0001g）和AE 166电子天平（感量：0.01g）（瑞士Mettler公司）。2样品处理：准确称取2 g样品（精确至0.01 g）于50 m

19、L具盖离心管中，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润。静置10 min后加入10 mL乙腈和50 mL内标（氯唑磷，20 mg/mL）至离心管中，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡1 min。将离心管置于0 条件下保持10 min，然后向离心管中加入Agilent SampliQ QuEChERS EN萃取试剂盒(Agilent 5982-5650)，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡2 min，然后以4000 rpm速率离心10 min。移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，加入Agilent QuEChERS 2 mL 分散固相萃取

20、试剂盒（Agilent 5982-5321），于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000 rpm 速率离心2 min。吸取上清液经0.22mm有机相滤膜过滤，移取200 mL，用乙腈稀释至1.0 mL，用LC-MS/MS检测。3.准备标准工作溶液：分别称取10mg三种农药标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成每种农药的单一标准储备液；移取一定量各农药的单一标准储备液于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合标准储备液；分别移取混合标准储备液25 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL , 500 mL 及1000 mL到6个10 mL容量瓶中，并加入50 mL内标（氯唑磷，20 mg/mL） 用乙腈定容，制得标准工作溶液； 然后分别移取上述标准工作溶液200 mL与200 mL的空白样品提取溶液混合，并用乙腈稀释至1.0 mL，配制成基质混合标准工作溶液。4.测定方法: 将配制好的不同浓度的农药基质混合标准工作溶液注入LC-MS/MS，以内标法进行残留量的