《酶免疫检验》PPT课件

1、标标 记记 免免 疫疫 技技 术术广东药学院公共卫生学院广东药学院公共卫生学院赵晓蓉赵晓蓉一、免疫标志与标志免疫的概念一、免疫标志与标志免疫的概念免疫标志技术：免疫标志技术：标志物与免疫活性物质的联接技术标志物与免疫活性物质的联接技术标志免疫技术：标志免疫技术：以标志免疫物质检测相应靶物质的以标志免疫物质检测相应靶物质的技术技术标志的目的标志的目的.?二、常用的免疫标志物质二、常用的免疫标志物质类别类别 标志物标志物 用途用途荧光素荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化免疫组化 镧系元素螯合物镧系元素螯合物 免疫分析测定免疫分析测定放射性核素放射性核素 3H、14C、32P、57G

2、r 免疫分析测定免疫分析测定 125I、131I酶酶 HRP、AP 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定化学发光物化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定免疫分析测定金属颗粒金属颗粒 胶体金、铁蛋白胶体金、铁蛋白 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定 FCM检测分析细胞外表受体的表达检测分析细胞外表受体的表达金金 免免 疫疫 技技 术术吸水纸吸水纸吸水纸吸水纸金标抗体金标抗体包被抗体包被抗体抗金标抗体抗金标抗体化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术 化学发光酶免疫测定：测定过程与传统化学发光酶免疫测定：测定过程与传统ELISA类似，仅最后一步酶反类似，仅最后一

3、步酶反响所响所 用底物为发光剂鲁米诺用底物为发光剂鲁米诺-过氧化氢发光体系过氧化氢发光体系一、按指示标志物质划分的类型一、按指示标志物质划分的类型二、按测定方式划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型三、按测定用途划分的类型1 1、酶免疫技术、酶免疫技术2 2、荧光免疫技术、荧光免疫技术3 3、放射免疫技术、放射免疫技术4 4、化学发光免疫分析技术、化学发光免疫分析技术5 5、金免疫技术、金免疫技术按指示标志物质划分的类型按指示标志物质划分的类型1、均相型、均相型homogenous2、非均相型异相型、非均相型异相型 heterogeneous按测定方式划分的类型按测定方式划

4、分的类型均相型均相型homogenous反响完成后，不用分别结合与游离的标志物反响完成后，不用分别结合与游离的标志物非均相型异相型非均相型异相型heterogeneous反响完成后，要分别结合与游离的反响完成后，要分别结合与游离的标志物。标志物。又可分为液相异相免疫测定和固相又可分为液相异相免疫测定和固相异相免疫测定异相免疫测定1 1、免疫测定技术、免疫测定技术2 2、免疫组化技术、免疫组化技术按测定用途划分的类型按测定用途划分的类型p熟习酶免疫技术的分类及原理；熟习酶免疫技术的分类及原理；p掌握掌握ELISAELISA的方法类型及各方法的原理；的方法类型及各方法的原理；测定方法的规范化；测定

5、方法的规范化；p熟习酶免疫组织化学技术的原理；了熟习酶免疫组织化学技术的原理；了解各类酶免疫组织化学技术；解各类酶免疫组织化学技术；p熟习免疫印迹法的原理。熟习免疫印迹法的原理。的酶催化底物呈色而对被的酶催化底物呈色而对被测物进展定测物进展定性或定量的标志免疫技术。性或定量的标志免疫技术。按检测对象的不同普通分为两类按检测对象的不同普通分为两类 1.1.酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。可指示待测反响物的存在和定位。可指示待测反响物的存在和定位。2.2.酶免疫测定技术酶免疫测定技术 用于检测液体样本中可溶性

6、抗原或抗体。用于检测液体样本中可溶性抗原或抗体。 根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量察看。察看。 根据抗原抗体反响后能否需求分别结合的和游离根据抗原抗体反响后能否需求分别结合的和游离的酶标志物，可分为：的酶标志物，可分为： 1. 1. 均相法：不需求分别结合和游离的酶标志物，直接均相法：不需求分别结合和游离的酶标志物，直接进展测定。进展测定。 2. 2. 异相法：需求分别结合和游离的酶标志物后才干进异相法：需求分别结合和游离的酶标志物后才干进展测定。展测定。 固相酶免疫：固相酶免疫：ELISA ELISA 液相酶免疫液相酶免疫根本原理根本原理 使抗原或

7、抗体结合到某种固相载体使抗原或抗体结合到某种固相载体外表，并坚持其免疫活性。外表，并坚持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶衔接成酶标使抗原或抗体与某种酶衔接成酶标抗原或抗体，且既保管其免疫活性又保抗原或抗体，且既保管其免疫活性又保管酶的活性。管酶的活性。 标本中的抗原或抗体、标志抗原或标本中的抗原或抗体、标志抗原或抗体能按一定的次序与固相载体外表的抗体能按一定的次序与固相载体外表的抗体或抗原反响。用洗涤的方法使固相抗体或抗原反响。用洗涤的方法使固相载体上构成的抗原抗体复合物与其他物载体上构成的抗原抗体复合物与其他物质分开。最后结合在固相载体上的酶量质分开。最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检

8、物质的量成一定的比例。与标本中受检物质的量成一定的比例。 参与酶底物，底物被酶催化变为有色参与酶底物，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反响的深浅对直接相关，故可根据颜色反响的深浅对标本中的抗原或抗体定性或定量分析。标本中的抗原或抗体定性或定量分析。n ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可用于测定抗原，也可用于测定抗体。双抗体夹心法双抗体夹心法 双位点一步法双位点一步法间接法间接法 竞争法竞争法 捕获法捕获法 双抗原夹心法双抗原夹心法中和法中和法n属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的属于非竞争结

9、合测定。它是检测抗原最常用的ELISAELISA，适，适用于检测分子中具有至少两个抗原决议簇的多价抗原，而用于检测分子中具有至少两个抗原决议簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。不能用于小分子半抗原的检测。 n n用衔接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检用衔接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决议簇结合，构成固相抗体测抗原分子上两个抗原决议簇结合，构成固相抗体- -抗原抗原- -酶标抗体免疫复合物。酶标抗体免疫复合物。n由于反响系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原由于反响系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的是过量的, ,因此复合

10、物的构成量与待测抗原的含量成正比。因此复合物的构成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于参与的底物后生成的有色物质量测定复合物中的酶作用于参与的底物后生成的有色物质量(OD(OD值值) )，即可确定待测抗原含量。，即可确定待测抗原含量。1 1将特异性抗体与固相载体衔接，构成固相抗体：洗涤除去未结合的抗将特异性抗体与固相载体衔接，构成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。体及杂质。2 2加受检标本：让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，构成固相抗加受检标本：让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，构成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。3 3加酶

11、标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。未结合的酶标抗体。4 4加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反响加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反响的程度进展该抗原的定性或定量。的程度进展该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。p属于双抗体夹心法测定抗原；属于双抗体夹心法测定抗原；p运用针对抗原分

12、子上两个不同抗原决议簇的单克运用针对抗原分子上两个不同抗原决议簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体；隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体；p标本的参与和酶标抗体的参与两步并作一步。标本的参与和酶标抗体的参与两步并作一步。p简化了操作，缩短了反响时间，如运用高亲和力简化了操作，缩短了反响时间，如运用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的运用使测定抗原的高。单克隆抗体的运用使测定抗原的ELISAELISA提高到提高到新程度。但要留意防止钩状效应。新程度。但要留意防止钩状效应。p用特异性抗原进展包被和制备酶结合物。用特异性抗原进展

13、包被和制备酶结合物。p构成构成“抗原抗原- -抗体抗体- -酶标志抗原复合物酶标志抗原复合物n此法是测定抗体最常用的方法此法是测定抗体最常用的方法, ,属非竞争结合属非竞争结合实验。实验。 n根本原理根本原理: :将抗原衔接到固相载体上，样品中将抗原衔接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原待测抗体与之结合成固相抗原- -受检抗体复合受检抗体复合物，再用酶标二抗物，再用酶标二抗( (针对受检抗体的抗体，如针对受检抗体的抗体，如羊抗人羊抗人IgGIgG抗体抗体) )与固相免疫复合物中的抗体结与固相免疫复合物中的抗体结合，构成固相抗原合，构成固相抗原- -受检抗体受检抗体- -酶标二抗复合

14、物，酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。特异性抗原与固相载体结合，构成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质；特异性抗原与固相载体结合，构成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质；加待测血清，血清中假设有相应的抗体那么与固相抗原结合，构成固相抗原加待测血清，血清中假设有相应的抗体那么与固相抗原结合，构成固相抗原抗体复合物。洗涤后，固相载体上仅剩下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质抗体复合物。洗涤后，固相载体上仅剩下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质不能与固相抗原结合被去除；不能与固相抗原结合被去除；加酶标抗免疫球蛋白酶标抗抗体与固相复合物中的

15、抗体相结合。洗涤后加酶标抗免疫球蛋白酶标抗抗体与固相复合物中的抗体相结合。洗涤后，固相载体上的酶量与待测血清中特异性抗体的量相关。假设欲测人对某种病，固相载体上的酶量与待测血清中特异性抗体的量相关。假设欲测人对某种病原微生物的抗体，可用酶标志羊抗人原微生物的抗体，可用酶标志羊抗人IgGIgG抗体；抗体；参与底物显色，颜色深浅代表样本中待测抗体量。参与底物显色，颜色深浅代表样本中待测抗体量。 方法和特点方法和特点: : 酶标志抗原抗体与样品或规范品中的非标志酶标志抗原抗体与样品或规范品中的非标志抗原或抗体具有一样的与固相抗体抗原结合的才抗原或抗体具有一样的与固相抗体抗原结合的才干；干； 测定管中

16、参与待测样本与一定量酶标抗原抗体测定管中参与待测样本与一定量酶标抗原抗体的混合溶液，使两者竞争性的与固相抗体抗原反的混合溶液，使两者竞争性的与固相抗体抗原反响；响； 免疫反响后，结合于固相载体上复合物中被测定免疫反响后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原抗体的量酶活性与样品或规范品的酶标抗原抗体的量酶活性与样品或规范品中非标志抗原抗体的浓度成反比。中非标志抗原抗体的浓度成反比。 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可用于测定抗原，也可用于测定抗体。n先将针对先将针对IgMIgM的第二抗体衔接于固相载体，用的第二抗体衔接于固相载体，用以结合以结合“捕获样品中一切捕获样品中一切IgMIgM特异

17、或特异或非特异，洗涤除去非特异，洗涤除去IgGIgG等无关物质，然后参等无关物质，然后参与特异抗原与待检与特异抗原与待检IgMIgM结合；再参与抗原特异结合；再参与抗原特异的酶标抗体，最后构成固相二抗的酶标抗体，最后构成固相二抗-IgM-IgM-抗原抗原- -酶酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检样品中待检IgMIgM能否存在及其含量进展测定。能否存在及其含量进展测定。 抗抗-链或抗链或抗-IgM-IgM抗体包被在固相上，构成固相抗抗体包被在固相上，构成固相抗-链或抗链或抗-IgM-IgM抗体，抗体，洗涤；洗涤；参与稀释待测样本，样本中一

18、切的参与稀释待测样本，样本中一切的IgMIgM与抗与抗-链结合，洗涤除去未结合物质；链结合，洗涤除去未结合物质；参与特异性抗原，它只与固相上特异性的参与特异性抗原，它只与固相上特异性的IgMIgM结合。洗涤；结合。洗涤；参与针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上抗原结合，洗涤；参与针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上抗原结合，洗涤；加底物显色，假设有颜色显示，那么表示待测样本中有特异性的加底物显色，假设有颜色显示，那么表示待测样本中有特异性的IgMIgM抗体存在。抗体存在。七、中和法七、中和法常用于知中和抗原检测样本中的未知常用于知中和抗原检测样本中的未知抗体。抗体。在固相上包被

19、知抗体，当检测样本中在固相上包被知抗体，当检测样本中含有待测抗体时，与反响体系中参含有待测抗体时，与反响体系中参与的中和抗原结合，反响过程不能与的中和抗原结合，反响过程不能构成构成“抗体抗体- -抗原抗原- -酶标志抗体复酶标志抗体复合物，参与底物不显色，实验结果合物，参与底物不显色，实验结果判为阳性；当检测样本中无待测抗判为阳性；当检测样本中无待测抗体时，参与的中和抗原那么与固相体时，参与的中和抗原那么与固相抗体结合，构成抗体结合，构成“抗体抗体- -抗原抗原- -酶标酶标志抗体免疫复合物，参与底物显志抗体免疫复合物，参与底物显色，实验结果判为阴性。色，实验结果判为阴性。ELISAELISA

20、中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。和酶的底物。1 1已包被抗原或抗体的固相载体免疫吸附剂；已包被抗原或抗体的固相载体免疫吸附剂；2 2酶标志的抗原或抗体结合物；酶标志的抗原或抗体结合物；3 3酶的底物；酶的底物；4 4阴性对照品和阳性对照品，参考规范品；阴性对照品和阳性对照品，参考规范品；5 5结合物及标本的稀释液；结合物及标本的稀释液；6 6洗涤液；洗涤液；7 7酶反响终止液酶反响终止液p固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白质的才干较强，抗体或蛋白质烯吸附蛋白质的才干较强，抗体或蛋白质抗原吸附

21、其上并保管原来的免疫活性。载抗原吸附其上并保管原来的免疫活性。载体的性状主要有三种：小试管、小珠和微体的性状主要有三种：小试管、小珠和微量量ELISAELISA板。板。p抗原和抗体：所用抗原要求纯度高，抗体抗原和抗体：所用抗原要求纯度高，抗体效价高，结合力强。效价高，结合力强。p酶和底物：酶和底物： ELISAELISA中最常用的酶有辣根过中最常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶氧化物酶和碱性磷酸酶n活性高活性高 n有可结合的基团，不影响抗原抗体的免疫活性有可结合的基团，不影响抗原抗体的免疫活性 n反响产物易于断定或丈量，方法简单反响产物易于断定或丈量，方法简单, ,敏感敏感, ,反反复性好复

22、性好 n酶活性不受样品中其他成分的影响酶活性不受样品中其他成分的影响, ,在均相酶在均相酶免疫测定抗原抗体反响后酶活性可被抑制或激免疫测定抗原抗体反响后酶活性可被抑制或激活活 n本身及产物无危害本身及产物无危害, ,性质稳定性质稳定, ,价廉易得价廉易得 n DH2 + H2O2 D + 2H2O 底物 受氢体 E 有色物质 辣根过氧化物酶 (HRP) 邻苯二胺(OPD) 灵敏度高,比色方便，稳定性差,避光,致癌 四甲基联苯胺(TMB) 稳定性好,无致突变作用，水溶性差碱性磷酸酯酶 (AP) 底物: 对硝基苯磷酸酯p-NPP 产物: 黄色的对硝基酚-半乳糖苷酶 (-Gal)底物: 4-甲基伞酮

23、基-D-半乳糖苷(4MuG) 产物: 4-甲基伞形酮(荧光计丈量)酶酶 底物底物 显色反应显色反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 橙黄色 492 四甲基联苯胺 黄色 450 氨基水杨酸 棕色 550 2,2-氨基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色 642 碱性磷酸酯酶 对硝基苯磷酸酯（p-NPP）黄色 405 -半乳糖苷酶 4-甲基伞酮基-D-半乳糖苷荧光 360,450 常用酶常用酶 底物底物 加终止液前颜色加终止液前颜色 加终止液后颜色加终止液后颜色 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRP） 邻苯二胺（OPD） 橙黄色 棕黄色 RZ3.1 四甲基联苯胺（TMB） 蓝色

24、 黄色 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 黄色 黄色 交联法交联法 交联法是以一可同时与酶和抗体抗原结交联法是以一可同时与酶和抗体抗原结合的交联剂作为合的交联剂作为“桥，分别衔接酶与抗体抗原桥，分别衔接酶与抗体抗原的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，构成的结合物为：构成的结合物为： 酶酶-1-1-戊二醛戊二醛-2-2-抗体抗原抗体抗原 1=2 1=2 同源双功能交联剂同源双功能交联剂 戊二醛戊二醛 1=2 1=2 异源双功能交联剂异源双功能交联剂 羟琥珀亚胺酯羟琥珀亚胺酯 戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，戊

25、二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm280nm，而聚合体那么在而聚合体那么在235nm235nm，故新颖的，保管得法的戊二，故新颖的，保管得法的戊二醛其醛其A235/A280nmA235/A280nm的比值小于的比值小于3 3。戊二醛应避光。戊二醛应避光. .低温低温保管。保管。 直接法直接法 直接法是用一活化剂首先将酶活直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体抗原结合构成标志物，如过碘酸钠法。构抗原结合构成标志物，如过碘酸钠法。构成的结合物为

26、：酶成的结合物为：酶- -抗体抗原。抗体抗原。 包被包被+封锁封锁 加样加样 洗涤洗涤 孵育孵育 终止反响终止反响 结果的断定结果的断定p将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被(coating)(coating)。p蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子构造上的疏水基团与合的，靠的是蛋白质分子构造上的疏水基团与固相载体外表的疏水基团间的作用。固相载体外表的疏水基团间的作用。p这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白

27、质较量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体外表。易吸附到固相载体外表。p包被用抗原：包被用抗原：p天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。类。p合成多肽抗原是抗原决议簇的氨基酸序列合成多肽抗原是抗原决议簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。普通只含有一个抗人工合成的多肽片段。普通只含有一个抗原决议簇，纯度高，特异性也高，但由于原决议簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，

28、间接地借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体外表。结合到固相载体外表。p包被用抗体包被用抗体pIgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其结合发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其结合发生在FcFc段上，抗体结合点暴露于外。段上，抗体结合点暴露于外。p取材于抗血清或含单克隆抗体的培育液取材于抗血清或含单克隆抗体的培育液. .须须除去杂抗体后才干用于除去杂抗体后才干用于ELISAELISA，以保证实验，以保证实验的特异性。的特异性。p腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需求作吸收层析处置，直接包被。因此不需求作吸收层析处置，直接包被。在某些情况下，用多种单抗

29、混合包被，可在某些情况下，用多种单抗混合包被，可获得更好的效果。获得更好的效果。包被条件包被条件pH9.6 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2 的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液蛋白质用包被液稀释后参与酶标板蛋白质用包被液稀释后参与酶标板100或或200l/孔，在孔，在4-8冰箱中放置过夜或冰箱中放置过夜或37中保温中保温2小时。小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批资料需经过实验与酶结合物的浓变化，每批资料需经过实验与酶结合物的浓度协调选定。度协调选定。普通蛋白质的包被浓度为普通蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。封锁封锁封锁封锁

30、(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封锁就是让大量不相关的蛋质溶液再包被的过程。封锁就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干后的步骤中干扰物质的再吸附。扰物质的再吸附。常用封锁剂：常用封锁剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 200BSA; 200l/l/孔孔10%10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度运用比较价廉，可以高浓度运用5%5%。 二加样二加样 定量测定加样量应力

31、求准确，加样时应将液体加在孔底，力求定量测定加样量应力求准确，加样时应将液体加在孔底，力求不产生气泡。样本和结合物的稀释应按规定配制。不产生气泡。样本和结合物的稀释应按规定配制。 普通普通100l/孔孔三洗涤三洗涤 洗涤是决议实验成败的关键。其目的是洗去没有与固相抗原或洗涤是决议实验成败的关键。其目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。抗体结合的物质，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 Tween 20在在ELISA中最为常用，洗涤效果好，并具有减少非特中最为常用，洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和加强抗原抗体结合的作用。常用异性吸附和加强抗原抗体

32、结合的作用。常用PBS- Tween 20。 洗涤步骤洗涤步骤 抗原抗体完成反响的保温过程称为孵育抗原抗体完成反响的保温过程称为孵育 加样品后、加结合物后都要孵育加样品后、加结合物后都要孵育 孵育常采用的温度有孵育常采用的温度有43、37、室温暖、室温暖4冰箱温度等。冰箱温度等。37是实验室中常用的保是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的适宜温温温度，也是大多数抗原抗体结合的适宜温度。度。 普通孵育普通孵育30-60min，温度低，时间可延伸。，温度低，时间可延伸。n硫酸硫酸 n n柠檬酸柠檬酸 n n氢氧化钠氢氧化钠 n n不同的底物有不同的终止剂不同的底物有不同的终止剂 p 分

33、光光度计检测结果可简单地用吸光度值分光光度计检测结果可简单地用吸光度值A表示，并表示，并且根据每次实验所用的阴性和阳性样本确定规范。且根据每次实验所用的阴性和阳性样本确定规范。p 普通以普通以A/A02.1A：样本吸光度值，：样本吸光度值，A0：阴性对照吸光：阴性对照吸光度值表示，但阴性对照吸光度值必需大于度值表示，但阴性对照吸光度值必需大于0.05最理想最理想的是的是0.1，假设低于，假设低于0.05，那么以阴性对照吸光度值加，那么以阴性对照吸光度值加0.05为阳性判别规范，这种结果断定方式目前最常用。为阳性判别规范，这种结果断定方式目前最常用。p 用规范抗原或抗体做一系列稀释度检测，将测定

34、的用规范抗原或抗体做一系列稀释度检测，将测定的A值绘值绘成规范曲线，可对样品中抗原或抗体定量。成规范曲线，可对样品中抗原或抗体定量。p 用肉眼判别结果时，所用的底物必需显示较深的颜色。肉用肉眼判别结果时，所用的底物必需显示较深的颜色。肉眼察看只能判别阳性和阴性如眼察看只能判别阳性和阴性如+、+、+、+/、。、。p 是在一定条件下，运用酶标抗体是在一定条件下，运用酶标抗体(抗原抗原)与组织或细胞标本与组织或细胞标本中的抗原中的抗原(抗体抗体)发生反响。如组织或细胞中含有相应抗原发生反响。如组织或细胞中含有相应抗原(抗体抗体)，二者结合构成的抗原抗体复合物中所带酶分子遇，二者结合构成的抗原抗体复合

35、物中所带酶分子遇究竟物时，催化底物产生显色反响，在光镜和电镜下，就究竟物时，催化底物产生显色反响，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原可识别出标本中抗原(抗体抗体)的分布位置和性质；经图像分的分布位置和性质；经图像分析也可到达定量的目的。析也可到达定量的目的。p EIHCT主要用于标本中抗原主要用于标本中抗原(抗体抗体)的定位和定性检测，的定位和定性检测，p 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，p 最常用的酶是最常用的酶是HRP，供氢体是，供氢体是DAB。p 与荧光免疫技术相比，与荧光免疫技术相比，EIHCT具有染色标本可长期保管。具有染色标

36、本可长期保管。可用普通光镜和电镜察看结果。可用普通光镜和电镜察看结果。p EIHCT可分为酶标志抗体免疫组化技术、非标志抗体酶可分为酶标志抗体免疫组化技术、非标志抗体酶免疫组化技术和酶免疫电镜技术三种类型。免疫组化技术和酶免疫电镜技术三种类型。 1 1、直接法、直接法 用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反响，构成抗原用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反响，构成抗原- -酶标抗体复合物，加底物显色，镜检。酶标抗体复合物，加底物显色，镜检。 其技术要点：标本用其技术要点：标本用0.3%H2O20.3%H2O2和和80%80%甲醇液处置甲醇液处置15 15 minmin，消除内源性过氧化物酶，石蜡切片需

37、常规脱蜡，消除内源性过氧化物酶，石蜡切片需常规脱蜡，用胰酶用胰酶3737消化，消化，PBSPBS洗涤；用洗涤；用10%10%牛血洁白蛋白封牛血洁白蛋白封锁锁15 min15 min，即制得抗原片；加酶标志抗体，湿盒，即制得抗原片；加酶标志抗体，湿盒3737温育温育30 min30 min或或44过夜，过夜，PBSPBS洗涤；加底物显色，洗涤；加底物显色，光镜下察看结果。光镜下察看结果。 该法具有操作简便、快速、特异性强、非特异显色低该法具有操作简便、快速、特异性强、非特异显色低的优点，但一种酶标抗体只能检测一种特异性抗原，的优点，但一种酶标抗体只能检测一种特异性抗原，敏感性较低。敏感性较低。

38、2 2、间接法、间接法 用知抗体用知抗体AblAbl与标本中相应抗原与标本中相应抗原AgAg反响，构反响，构成成Ag-AblAg-Abl复合物，加酶标志抗抗体复合物，加酶标志抗抗体Ab2-EAb2-E反响，反响，构成构成Ag-Abl-Ab2-EAg-Abl-Ab2-E复合物，加底物显色，镜检。复合物，加底物显色，镜检。 其技术要点：按直接法制备抗原片，加其技术要点：按直接法制备抗原片，加AblAbl如如鼠抗鼠抗X X，湿盒，湿盒3737温育温育30 min30 min，PBSPBS洗去未结合洗去未结合AblAbl；加酶标志抗抗体如羊抗鼠加酶标志抗抗体如羊抗鼠IgIg，湿盒，湿盒3737温育温育

39、30 30 minmin，PBSPBS洗涤；加底物显色，光镜下察看结果。洗涤；加底物显色，光镜下察看结果。 间接法用一种酶标志抗抗体与多种特异性抗体结合，间接法用一种酶标志抗抗体与多种特异性抗体结合，可检测多种抗原，适用性与敏感性均较直接法好。可检测多种抗原，适用性与敏感性均较直接法好。原理原理酶标志抗体的方法，由于酶与抗体共价衔酶标志抗体的方法，由于酶与抗体共价衔接，抗体和酶的活性均遭到一定的损害，接，抗体和酶的活性均遭到一定的损害，假设非特异性抗体同时被标志，将出现假设非特异性抗体同时被标志，将出现非特异性着色。非特异性着色。非标志抗体酶法，是先用酶免疫动物，制非标志抗体酶法，是先用酶免疫动物，制备高效价、特异性的抗酶抗体，将酶与备高效价、特异性的抗酶抗体，将酶与抗酶抗体结合构成复合物，然后利用第抗酶抗体结合构成复合物，然后利用第二抗体二抗体Ab2Ab2作桥，与抗酶抗体和组织作桥，与抗酶抗体和组织抗原上的抗体抗原上的抗体Ab1Ab1结合，经过酶底物结合，经过酶底物的显色反响检测抗原。的显色反响检测抗原。1、酶桥法、酶桥法 特异性抗体特异性抗体Ab1与组织标本的抗原反响后，用抗与组织标本的抗原反响后，用抗-Ab1抗体抗体Ab2，