[精品]总状毛霉生物转化孕酮的研究

1、总状毛霉生物转化孕酮的研究总状毛霉生物转化孕酮的研究摘要：为筛选径基化多样性的菌株，对总状毛霉(mucor racemosus)生物转化孕酮进行研究。转化产物经hplc分析，共分离 到6个转化产物，通过nmr、ms及ftir等手段对孕酗转化产物进行 结构鉴定。其结构为11 q -径基孕酮(1)； 15 a -轻基孕酮(2)； 11 a , 15b-二疑基孕酮(3)； 6b,11a-二轻基孕酮(4)； 7b, 15b-二轻基孕酮(5)； 1-脱氢11 a-轻基孕酗(6)o研究结果表明，总状 毛霉转化孕酮的衍生物具有丰富的多样性。关键词：生物转化；总状毛霉(mucor racemosus)；孕酮;

2、结构 鉴定中图分类号：0621. 3文献标识码:a文章编号：0439-8114(2014) 03-0666-031952年murray等1利用黑根霉转化孕酮得到11 q -轻基孕酮, 并在笛体工业中大规模应用，由此微生物转化技术在番体药物生产中 的重要性被广泛认识。而帑体化合物的径基化是微生物转化技术应用 的主要方面。径基化反应是當体化合物生物转化反应中最重要的反应, 由于笛体母核上4个环上有多个次甲基，用化学法进行轻基化很难区 分，不能反应的区域选择性及对映体选择性，微生物能够专一地在帑 体母核或侧链上引入一个或多个径基，疑基化改变了笛体的极性，进 而影响其毒性、细胞分泌及药物分布，从而产生

3、不同的药效，并可应 用于帑体药物工业生产2。帑体化合物的疑基化是微生物转化技术 应用的主要内容，已有较多的文献报道3-6 o筛选优良菌株、发掘新的生物催化剂是发展我国當体工业的重耍 课题。而寻找径基化多样性丰富的菌株，可产生多种轻基化衍生物， 在笛体药物研发中会起到事半功倍的作用。已有总状毛霉(mucor racemosus)转化笛体化合物的报道7-11，但未见转化孕酮的研究。 本研究以实验室保藏总状毛霉菌株对孕酮进行了生物转化研究，筛选 转化笛体化合物的催化系统，将來可进一步用于转化其它的笛体药物 及药物中间体，为该菌株在开发笛体药物中的应用提供依据。1材料与方法1.1材料孕酮购口江苏省盐城

4、信谊医药化工有限公司，经nmr及hplc检 测纯度超过98%。1.2微生物菌株总状毛霉为实验室保藏菌株，分离自重楼根状茎。1.3粗提物制备转化用发酵培养基含 3 g/l nan03. 1 g/l k2hp04、0. 5 g/l mgs04 7h20、0.5 g/l kc1、0.01 g/l fes04 7h20、30 g/l 蔗糖、孕酮 1.0 g/l (ph 6.5),孕酮加少量乙酸乙酯溶解，再加4 g/l吐温80 混匀，加水形成乳浊液加入1 l培养基。250 ml锥形瓶装入100 ml 发酵液，共发酵10 lo于28 °c, 220 r/min振荡培养6 do发酵液 用乙酸乙酯萃

5、取，菌丝体用甲醇浸泡超声提取，真空浓缩合并得到粗 提物。1. 4 hplc 分析取0.1 g粗提物，加入1 ml甲醇溶解，用0.25 um滤膜过滤。 色谱柱，agilent zorax sb-c18 柱(4.6 cmx150 mm, 5 um)；检 测器，二级管阵列检测器；流动相，甲醇-水(60/40, v/v)；流速, 1.0 ml/min；检测波长，244 nm；柱温，40 °c；进样量，5 » l。通 过峰面积积分对各转化产物产率进行计算。1. 5孕酮转化产物的分离纯化正相硅胶(200-300目):样品二8 : 1 (v/v)装柱上样，以石油 瞇-乙酸乙酯体积比为9

6、: 1-1 : 9逐级梯度洗脱，含转化产物组分用 半制备型高效液相色谱制备,色谱条件，甲醇:水=50 : 50 (v/v), 流速为3 ml/min,检测波长为244 nm,柱温为40 °c。2结果与分析2. 1转化结果hplc分析由图1可看出，孕酮基本被转化，转化产物极性较大，且种类很 丰富。2. 2孕酮转化产物分离及结构鉴定经半制备分别得到6个组分:s、s2、s3、s4、s5、s6。经核磁 共振、紫外、旋光、熔点检测，结构鉴定分别为：ila -轻基孕酮（1）； 15q-轻基孕酮（2）； 11a , 15b-二径基孕酮（3）； 6 b, 11 a-二轻 基孕酮（4）； 7 b ,

7、15 b -二耗基孕酮（5）； 1-脱氢11 a -耗基孕酮（6）。化合物的理化鉴定结果如下：（1）11q-轻基-4-孕笛烯-3,20-二酮 收率为7. 2%；熔点:4.03 （td,165169 °c； 1h nmr 8 :5. 73(s,iii, 11-11),2.55(m, iii, 11-17),0.69(s,1h,h-4),311,1.31(s,3h,h-19),2. 13(s,3h,13c11-18),nmr 8 :37.65(c-l),34.30 (c-2),200.31 (c-3),124. 72(c-4),170. 95(c-5),33.70(c-6),31.64

8、(c-7),35.07(c-8),55.47(c-9), 40.05 (c-10), 69.02 (c-ll),50. 5844. 26(c-13), 55.47 (c-14), 24.36 (ct5),23. 07(c-16),(c-20),63.24 (c-17), 14.62 (c-18),18.42 (019), 208.93与文献12对照一致。 收率为9. 8%；熔点:229ii-4),4. 10 (td, iii,31.49(c-21)； ms m/z： 353m+ na +。(2)15a-耗基-4-孕當烯-3, 20-二酮233 °c； iii nmr 各：5. 74

9、(s, iii,11-15),2.81(s, iii, 11-17),0.69(s,311,ii-18),1.20h-21)； 13cnmr 6 :35. 86(c-l), 34.07 (c-2),199.57 (c-3),124.01 (c-4),170.81(s,3h,h-19),2. 13 ( s, 3h,(c-5), 32. 84(c-6), 31. 10 (c-7), 35. 32 (c8), 53. 82 (c-9),38. 71(c10),21. 00(c-ll),38.99 (c-12), 44.68 (013),61.00(c-14),73. 5035. 44 (c-16),

10、 62. 92 (c-17),14. 76(c-18),17. 60ms m/z： 353 m+na+。208. 45 (c20), 31.71 (c21)；<!一-startprint一->二酮收率为5. 7%；熔点：230240 °c；1h, h-4), 4.05 (m, 1h, ht1), 4.32(c-19),与文献13对照一致。<!-endprint-> (3) 11a , 153-二轻基-4-孕笛烯-3, 20- 1h nmr 8 :5. 75(s,(m, 1h, h-15), 2.51(t, iii, 11-17), 0.97 (s, 3h, 1

11、1-18),2. 15 (s, 311, h-21)； 13cnmr 8 : 35.921.35(s, 3h, ii-19),(c-l), 34.04 (c-2),201.64 (c-3),30.62(c-7),68.04 (c-ll),69. 39 (c-15),124. 15 (c-4),31.24 (c-8),51.25 (c-12),37. 25 (c-16),173.01 (c-5),58.82 (c-9),43.82 (c-13),63.40 (c-17),33. 64 (c-6),40.20(c-10),59.37 (c-14),16. 90 (c-18),18. 08 (c-1

12、9),209.45 (c-20),31.28 (c-21)； ms m/z:369m+na +。与文献13对照一致。(4) 6 b, 11 q-二為基-4-孕笛烯-3, 熔点：245248 °c； 1hnmr 5 :5. 78(t, iii, ii-17), 0. 73 (s, 311, 11-18),20-二酮收率为32. 8%； (s,1h,h-4 ),2.681.49 (s, 311, ii-19),2. 14 (s,3h,1h,h-6),h-ll)； 13c nmr126. 00 (c-4),h-21), 4.34 (m,8 : 37.46 (c-l), 3412(c2),1

13、70. 55 (c-5),72. 08 (c-6),28.22(c-8),58. 36 (c-9),39. 15 (c-10),4.09 (m,1h,202. 76 (c3),38.6168.03(c-7),(c-ll),49. 43 (c-12),44. 12 (c-13),55. 11 (c-14),23.98(c-15),22. 73 (c-16),63.07 (c-17),14. 06 (c-18),19. 51(c-19),210. 63(c-20),30. 97(c-21)； ms m/z： 369 m+ na +。与文献14对照一致。(5) 7 b, 15 0-二轻基-4-孕當烯

14、-3,20-二酮 收率为43. 4%；熔点：243250 °c； iii nmr 6 :0.96 (s,311,11-18),1.24(s, 3h, h-19), 2. 15 (s, 3h, h-21), 3.63 (m, 1h, h-7),4.46 (m, iii, 11-15), 5. 76 (s, iii, 11-4)； 13cnmr 5 : 35. 56 (c-l), 33.81 (c-2), 200.42 (c-3),124.48 (04),168.63(c-5), 42. 32 (c-6), 71. 12 (c-7), 38. 68 (c-8), 50. 90 (c-9)

15、,38. 06(c-10), 20. 93(c-ll), 39.51(c-,43. 90(c-,60.24(c-14), 73.34(c-,33.48(c-16),63.39(c-17),15.41 (c-18), 17.24 (c-19), 209.52 (c-20), 31.41 (c-21)； ms m/z： 369 m+ na +。与文献15对照一致。(6) 11a-轻基-1,4-孕笛二烯-3,20-二酮 收率为1.2%；熔点：225230 °c； 1h nmr 5 : 6. 09 (s,1h, h-4), 7. 77(d, iii, h-l), 6. 16 (dd, iii

16、, ii-2), 2.52 (m, iii, ii-17),0. 70 (s ,311, ii-18), 1.30 (s, 311,ii-19), 2. 12 (s, 311,h-21), 4.04 (m, 1h, h-ll)； 13c nmr s : 158.89 (c-l),125. 31 (c-2), 186. 95 (03), 124. 74 (04), 168. 05 (c-5), 33. 16 (c-6), 33.50 (c-7), 34.40 (c-8), 60.43 (c-9), 44.06 (c-10), 68.06 (c-ll), 49.93 (c-,44. 09 (c-1

17、3), 54.96 (c-14), 23. 15 (c-15),24.48 (ct6),62.92 (c-17), 14.51(c-18), 18. 74 (c-19), 208. 86 (c-20), 31.47 (c-21)； ms m/z： 351m+na +。与文献16对照一致。2. 3转化途径推测根据化合物出现顺序及结构特点，对其结构推测如图2。首先, 孕酮c-11.c-15超基化分别转化成11 a -轻基孕酮、15 a -轻基孕酮, 然后11 a-拜基孕酮乂同吋进行两个方向转化：一个方向是转化成 ila, 15b-二轻基孕酮和6 b, ila-二轻基孕酮；另一个方向是通 过c-kc

18、-2脱氢酶的作用转化成1-脱氢11 a -轻基孕酮。此外,7 b , 15 b -二耗基孕酮转化率相对较高，而且转化产物中没发现7 b -耗基 孕酮和15 b-轻基孕酮的衍生物，因此可以推测孕酮是直接转化成 70, 15b-二径基孕酮。3小结与讨论总状毛霉转化孕酮得到6个转化产物,分别在c-6、c-7、c-11. c-15实现径基化，表明孕酮具有多个位点可以通过生物修饰。通过 木研究转化产物7 b , 15 b -二耗基孕酮、15 a -拜基孕酮与7 a , 15 0 - 二轻基孕酮、15b-径基孕酮相比较，可以说明同一底物在不同微生 物的转化条件下，能在同-位点进行对映体选择，产丰不同构效的

19、化 合物，由于化合物的构效不同，其对机体可能会产生不同的药物特性 17,这需要人们更多的发现。孕酮具有多个可以生物修饰位点，而 且同一位点能进行对映体选择，由此孕酮可以转化成多样性丰富的衍 生物。<!-endprint-> <!-startprint->转化产物 6 还发生了 1位的脱氢，表现出菌株转化多样性。说明总状毛霉不但有疑化 酶存在，而且还有脱氢酶的存在，耗基化酶和脱氢酶属于细胞色素 p450酶系18,这也说明细胞色素p450酶系的多样性，为其在其他 笛体药物及药物中间体转化中的应用提供了依据。参考文献：1 murray h c, peterson d h. o

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