长期施肥田间试验的土壤粒级中微生物的群体结构

1、高级农业生态学作业Microbial Population Structures in Soil Particle Size Fractionsof a Long-Term Fertilizer Field ExperimentANGELA SESSITSCH et al.长期田间施肥试验的土壤粒级中微生物的群体结构的阅读研究报告报 告 人：于小彬学 号：2013202009 专 业：作物栽培学与耕作学 任课教师：李立军 日 期：2014年3月31日科学问题有机质种类和/或颗粒大小是否控制着土壤不同颗粒中特定微生物群体的分布。 假设H1:有机质种类单独起作用;H2:颗粒粒级单独起作用;H3:两

2、者联合交互起作用;H0:两者均无效。试验设计表土样品（0-20cm）取自1998年秋季Ultuna的长期施肥实验地。 整个实验开始于1956年，实验进行了14种处理，其中每一种处用随 机区组设计重复4次。 本实验中，只分析七个处理的样品。持续的完全休闲耕作；无氮，地块不施氮肥； Ca(NO3)2每年每公顷80Kg的氮；GM，绿肥；AM，充分腐熟的动物肥料；泥炭； SS，下水道污泥有机修复物在施用前进行分析，并且将等量有机质（Ca(NO3)22000Kg/ha/year)于1956，1960,1963年添加进去，这以后每隔两年手工添加一次。而且，每年春天以过磷酸盐的形式施入20KgP 每公顷，以

3、氯化钾的形式施入35至38kg K每公顷。麦类，油菜，作物，饲料用甜菜交替种植。结果1、T-RFLP 分析1、在所有的处理中，沙粒中的细菌多样性最低，粘粒中的最高。唯一例外的是泥炭作有机修复物的处理，其T-RFs数最高出现在粉粒中（表1）。涉及绿肥（GM）和腐熟动物肥(AM)的处理表现出更高的细菌多样性，特别是粘粒中，相比于其他有机修复物。另外，GM中的沙粒表现出异常高的多样性，相比于其他处理中的沙粒。在几绿肥出处理的几个处理中，一些片段表现出远远更大的荧光信号。2、只有197bp（GM）,253bp(GM,AM),290bp(GM,AM,SS)三个T-RFs只在沙粒中发现。检测的大多数沙粒中

4、的T-RFs也同样出现在粉粒和粘粒中（表2）。一大部分（T-RFs）在粉粒和粘粒中发现，但没有出现在沙粒中。细菌中大小为76bp和311bp（均是休闲耕作，Fallow）的T-RFs至存在于（定殖于）粉粒中，很多T-RFs只发现于粘粒中。3、沙粒中检测的多数T-RFs表现出集中的荧光信号，片段大小组成有：39,60,62,66,81,194,197,205,208,212,223,228,231,253,290,294,297,304，以及379bp(表2，图1)。2、序列分析及遗传进化分析排布1、24h测序表现出与RDP数据库记录条目高相似性，其中30个序列表现出与NCBI数据库中存储的已知

5、序列有至少95%的相似性（表3）。剩余的序列与已知的16S RNA基因，未描述的细菌分类成员以及有描述的分支很远的成员只有中等（90-94%）相关性。这个进化树知识建立在部分测序，它展示的属于Holophaga/Acidobacterium簇类细菌的大量多样性，而不是确定的遗传进化关系如图3中展示。2、所有测序的克隆菌的理论HaeIII-HhaI T-RFs 在T-RFLP分布图中可以看到。理论的T-RF132bp是唯一的例外，没有在T-RFLP 分析中检测到。几个序列表现出相似的T-RFLP大小（表4）。实验发现遗传进化和土壤中空间的位置的关系。一些细菌组，如Holophaga（全噬菌属 ）

6、/Acidobacterium（乳酸杆菌属）簇类，大多数Prosthecobacter（突柄杆菌属 ）成员，是更小颗粒中主要的存在菌，而Proteobacteria（变形菌门）在各种颗粒中分布大致相当。讨论1、细菌与土壤颗粒级的联系更细小的颗粒为微生物提供一个阻挡捕食者的保护性的微生境可能，更小颗粒中的提供的高大量可利用的营养可能是更高细菌多样性的原因2、粒级中细菌对有机修复物的响应我们的微生物群体分析的结果反映了在有机碳Corg轮转的报道中的内容。通常情况，GM和AM处理中土壤的丰富度最高，在无或非有机肥的土壤中最低，并且与施入肥料的利用率相一致。修复物中的SS，泥炭作为肥料导致了相当独特的

7、细菌群体结构，这归因于不同的组成而不是增加或者降低多样性。两个实验表现出非常低的PH值（5.8），这可能是有一些群落的改变造成的。泥炭和SS处理没有一些其他处理中检测到的一些T-RFs 。它们包括Holophaga/Acidobacterium division(95, 236, and 242 bp), Prosthecobacter (236 bp),或者 low G C革兰氏阳性。这些细菌可能没有不能忍受酸环境。其他属于Holophaga/Acidobacterium门的细菌，还有Prosthecobacter种的能够定殖在多数的处理中除了含有SS的土壤。一些微生物群对SS中高浓度金属的

8、敏感性可能解释上述现象。3、总结群落的T-RFLP of 16S rRNA基因分析，被证明是高适的，高灵敏的调查不同颗粒粒径，不同处理中微生物群落结构的工具。三个常规的重复样品，每一个粒级和处理表现出可比较的群体分布图，并且能很好在聚类分析中归类。大量的T-RFLP分析，必须很谨慎的处理，因为在不同的细菌菌种中，存在PCR扩增的系统偏差以及16S rRNA基因的复制数的变异。可是，注意到了这些限制，T-RFLP分析可以被用来做细菌群落的半量分析。本实验中，微生物的组成主要受颗粒粒级的影响，并且确实更少程度的响应有机修复物的处理。因此，我们的结果表明，特定的微生物-粒级联系，并且这个关联只有很小

9、程度受外界因素，如肥料或重金属污染，的影响。微生物群落结构的认识代表了对土壤粒级对环境响应理解的第一步。群落结构以外，在给定群体功能基因的分析将会增加我们对细菌在土壤处理中作用的理解，而土壤处理对地球化学元素，特别是碳，氮，硫的动态非常重要。评价此试验从微观的角度，选择检测微生物的种类来表示不同处理三个颗粒级中微生物的多样性，从16SrDNA的水平阐释了具体各个施肥处理土壤中三个粒级中细菌的具体种类，并且多试验中的现象做了较为合理的解释。T-RFLP是一种成熟的研究微生物多样性的技术，值得在以后研究微生物的试验中应用。长期田间施肥试验的土壤粒级中微生物的群体结构摘要：土壤结构依赖于矿质土壤颗粒

10、（砂粒，粉粒，粘粒）与有机质的结合。结构里形成了大小，稳定性不同的聚合体。虽然已经很好的研究了不同颗粒中有机化学物质，总生物量以及不同土壤酶活性，但是关于微环境中微生物群体的结构的信息却很少。本研究中，我们分析了长期田间试验的不同施肥处理中表土样品。通过低能量的声波降解法，湿法筛分和重复离心的组合，获得颗粒粒径200至63µm（细砂粒），63至2µm（粉粒），2至0.1µm（粘粒）的土壤颗粒。通过末端限制片段长度多态性分析，16sRNA基因的克隆和测序，比较不同土壤粒级中细菌的群落结构。微生物结构很大程度受颗粒大小影响，并且小粒径中的微生物比粗粒径中的产生更高的多

11、样性。更高的生物量早先在粉粒和粘粒级中发现，可能归结于更高的微生物多样性而不是更好的特定种群的定居。低营养的提供，原生动物的摄食以及真菌生物的竞争可能是大粒径中减少的多样性的原因。而且，大粒径中-变形菌门数量占有绝对优势，然而属于全噬菌属/酸杆菌门部分的细菌，其高丰富度和多样性发现于更小的粒径中。虽然相互间差异非常大的有机修复物（绿肥，畜肥，污水污泥，泥炭）也被实验，但是我们的结果显示细菌群落的结构，相比于施肥的种类，更大程度受颗粒粒级的影响。因此实验结果显示了特有的微生物-颗粒关联，并且这个关联只有很小程度受外界因素的影响。1引言土壤结构依赖于矿质土壤颗粒（砂粒，粉粒，粘粒）和有机质的结合。

12、结构里形成了大小，稳定性不同的聚合体。耐机械化的微聚合体从初始颗粒和微生物，植物根系，真菌菌丝，多糖以及腐殖质的相互作用进化而来。它们构建了的微聚合体（>250µm）明显欠稳定，而且很容易被农事管理破坏。这类聚合体通过根系和菌体紧紧的团在一起。土壤颗粒的结构组织为微生物提供了一个空间化混杂的微生境，这些微生境具不同的基质，营养，氧气浓度及水分含量，还有不同的PH值。以前运用了不同的方法研究了土壤基质中有机质和微生物的分布，如电子显微镜分析，土壤聚合体的反复冲洗以及基于土壤物理分级技术。有几个研究已经表明细胞数量和微生物量最大集中于更小的粉粒和粘粒颗粒中。因为土壤聚合体的大小和土

13、壤孔隙度是相关联的，微生物量也主要出现在微孔隙（5至30µm）中。而且，已经报道，在粉粒和粘粒中，土壤酶中脲酶，蔗糖酶及碱性磷酸酶活性是最高的，而在细砂粒中木聚糖酶的活性为最高。后面的木聚糖酶已经提议作为真菌活性的的指示物。虽然研究已经表明，在绿地和耕作地中真菌生物量相比于细菌生物量低，但是在有机质的早期分解中真菌却起到了重要的作用。土壤微生物群落表现出极高的表现型和基因型多样性，DNA复性实验表明每一克土壤中相当有4×103至7×103的不同基因组。微生物多样性在几个研究中一直被实验；然而，只能得到少量的关于微环境中微生物群体的结构信息。例如Gelsomino

14、et al.反应在预实验中，通过湿法筛分处理获得的不同大小土壤聚合体中都有相似的细菌类型分布。另外Kandeler et al.最近通过磷脂脂肪酸分析和16srRNAs的变性剃度凝胶电泳，表明粘粒中微生物生物量的主要归因于细菌的定殖。与之相反，在粗砂粒中，发现高百分比的真菌脂肪酸衍生物，这些物质与特定的有机质相关联。虽然这些出版物提供了初步的有关这些微生境中微生物群落结构的洞悉，但是，是否有机质种类和/或颗粒大小控制着不同土壤颗粒中特定微生物群体的分布，这仍然没有被很好的了解。本实验的目的是检验微生物群体结构对土壤颗粒粒级中有机质种类的改变是否响应，土壤取自瑞典Ultuna的长期施肥试验地。低

15、能量声波降解法后的物理分级处理，与不同颗粒大小中的微生物群落的分析相结合。用基于DNA的方法，是因为在自然环境中的大多数细菌无法成功培养。16srRNAs基因已经成为频繁使用的系统发生学标记，用来描述土壤中微生物多样性，而这不需要微生物培养。以前，末端限制性片段长度多态性（t-RFLP）分析及16srRNAs的克隆和测序被应用于分析细菌多样性。这个长期施肥的实验，其有关营养周转，土壤有机质片段，土壤物理丰富度的改变及酶活性的研究已经早先发表了。2 材料和方法：2.1 地点和样品表土样品（0-20cm）取自1998年秋季Ultuna的长期施肥实验地。实验内容和数据的详细整理，可以从 Kirchm

16、ann等人的报告中找到。实验开始于1956年，当时土壤（0-20cm）的有机碳为15g/kg，氮为1.7g/kg,PH=6.6。 实验进行了14种处理，其中每一种处用随机区组设计重复4次。本实验中，分析了七个处理的样品：持续的完全休闲耕作；无氮，地块不施氮肥；Ca(NO3)2每年每公顷80Kg的氮；GM，绿肥；AM，充分腐熟的动物肥料；泥炭；SS，下水道污泥。有机修复物在施用前进行分析，并且将等量有机质（Ca(NO3)2 2000Kg/ha/year)于1956，1960,1963年添加进去，这以后每隔两年手工添加一次。而且，每年春天以过磷酸盐的形式施入20KgP 每公顷，以氯化钾的形式施入3

17、5至38kg K每公顷。麦类，油菜，作物，饲料用甜菜交替种植。2.2 分级处理大小分级过程依据 Jocteur Monrozier et al的方法，用已筛过样品（<2mm)按照Stemmer et al的详细描述执行操作。非常重要的是，土-水悬浮液用低能量的声波降解法（输出能量0.2Kj/g）混匀，随后通过湿法筛分和重复离心的组合分级以免避免微聚合体破裂。200至63µm（细砂粒），63至2µm（粉粒），2至0.1µm（粘粒）的颗粒粒级的获取中无凝聚剂的添加。分级的样品冷冻干燥。2.3 DNA提取对DNA的提取，我们对van Elsas和malla描述的方

18、案做了稍微修改。冷冻干燥的土壤（0.3至1.0g）和0.38g的溶菌酶再次悬浮在0.75mld的0.12mol磷酸钠缓冲液（PH=8.0）中，混合物在37培养15分钟。样品一直放在冰上冷却，加入750mg酸洗的玻璃微珠，微珠搏动在混合磨机（type MM2000; 220 V, 50 Hz; Retsch GmbH & Co. KG, Haam,Germany)）中以最高速度运行90s，进行三遍，间隔30s。加入SDS(45 l of a 20% solution)后混合物在室温下培养15min。接着，加入一体积的苯酚，混合物混匀后在10000g下离心5min。有机段层用0.12MSD

19、S再次提取，水层用1体积的氯仿混成一体提取，再在10000g下离心5min后，向水层加入 1体积5M醋酸钾，室温下沉淀腐殖酸15min。样品在10000g下离心5min，上清液加入0.1 体积5M NaCl and 0.7体积异丙醇校订，并在-80下培养30min以沉淀DNA。DNA在10000g下离心10min获得，产生的球粒用70%的乙醇洗涤，在80µLTE10（mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA）中干燥，再悬浮。为了进一步纯化，准备了含琼脂糖凝胶 CL-6B 和聚乙烯吡咯烷酮 的纯化柱。在多数情况下，通过两个柱的通道需要去除所有抑制PCR的物质。2.4 T-

20、RFLP 分析真细菌的引物8f，用羧基荧光素标记5末端，518r被用来扩增大约530bp的16srRNA基因。反应在PTC-100热循环仪中进行，先5min 95初步变性，接着95下35次30s的循环，1min54的退火2min72下的延伸。PCR混合物（50µl）包含1×反应缓冲液，200µM （每一个）dATP,dCTP,dGTP,dTTP,0.15µM引物，3nM MgCl2;2.5 U Taq聚合酶；20ng模板DNA。PCR产物放进20µl HhaI and HaeIII 10U 的组合限制性酶液中消化2h。用几个在4-bp识别位点限

21、制酶的预实验表明 HhaI and HaeIII 10U 的组合产出的末端限制性片段（T-RFs）较多相比于其他酶。整分（1µl）中混入0.16µl甲酰胺，0.83µl加样缓冲液，0.3µlDNA标准片段长度液。反应混合物在92下变性2min，电泳前放在冰上冷却。样品在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用ABI373ADNA自动测序仪，分析荧光标记的限制末端大小。标记片段的长度通过与内标物的比较测出。2.5 T-RF分布图的分析分析中考虑T-RF 在35至500 bp段波峰并且依据大小标记物的范围包括了峰高 50荧光单位。通常情况，用DNA自动测序仪测定片段

22、大小的错误小于1bp，可是，在一些情况下，会出现较高的变异度。因此，只要小于1.5bp 差异的T-RFs都被归为一类，除非能重复的检测出一些个体的波峰。每个处理的三个重复样品和颗粒大小要么被单独的分析，要么样品分别用相同的方法检测，方法参照Dunbar et al。重要的是，在每一个重复分布图计算出峰高的总和，表示为总的DNA 量。总的吸收的荧光通过计算校正因子调整到中DNA的量。例如三个重复分布图的总的荧光吸收值，4500，4700，4900，每一个波峰在后者的分布图, 在后一个图中的每一个波峰乘以因子0.96，第一个图中的波峰乘以因子1.04。调整后的只考虑50荧光单位的波峰。而且，T-R

23、Fs在至少2/3的重复中，得分是积极的。为了测定T-RFP分布图的相似性，创建了记录绑定片段缺失和存在的二元矩阵。基因长度的估计参考Nei和Li，并且结合 UPGMA (数学平均值未加权两组) 的方法，用来比较T-RFP酶解图谱。用TREECON软件包做分析和建进化树形图。2.6 小亚基 rDNA 克隆文库从AM处理中粘粒中DNA提取用于创建16S rDNA克隆文库。16S rRNA基因用引物8f通过PCR在上述PCR条件下扩增，PCR扩增物大约1500bp长，与绑定到噬菌体质粒载体，转化到Escherichia coli DH5 活性细胞中。经过一夜的转化后，单细胞克隆菌落被转移至含有1.5

24、mlEppendor管中，管内80µlTE缓冲液。Eppendor管加热至9510min以溶解细胞，于冰上冷却，在13000rpm下离心2min，上清液用于后续PCR。2.7 克隆嵌入物PCR产物测序插入序列通过PCR扩增，先5min 95初步变性，接着95下30次30s的循环，1min50的退火，2min72下的延伸。PCR混合物（50µl）包含1×反应缓冲液，200µM （每一个）dATP,dCTP,dGTP,dTTP,0.15µM引物M13和M13rev；2.5 U Taq聚合酶；1µl来自转化株细胞溶解的上清液。PCR产物通过

25、参照NucleoTraPCR kit厂家的介绍说明纯化，纯化产物用作测序反应的模板。DNA用ABI373ADNA自动测序仪和 ABI PRISM Big Dye 终止循环测序工具(Perkin-Elmer)测序。2.8 遗传进化分析测序是利用NCBI数据库依照BLAST分析并和可测序的RDP做了比较。相关测序的校准利用了 Multalin校准工具做的，工具在网上（http:/www.toulouse.inra.fr/multalin.html)可以得到。用TREECON软件包计算了距离矩阵，并依据最近相邻原则建了进化树形图。2.9 核苷酸序列检索号本实验测得的核苷酸序列存储于NCBI数据库序列

26、号为no. AF388312 to AF388362.3 结果3.1 T-RFLP 分析在不同施肥处理的长期施肥试验的不同颗粒片段中细菌群体结构用T-RFLP分析来检测（图1）。重复表现出一定程度的变异，可是，当比较所有分布图时，它们会被分到一组。因为一些片段只出现在个别重复中，所以检测了总的55T-RFs，具有代表性样品分布图中总的T-RFs数减至43。在单个样品的分布图中T-RFs数范围从7（休闲耕作和泥炭，沙粒）至26（腐熟动物肥，粘粒）（表1）。在所有的处理中，沙粒中的细菌多样性最低，粘粒中的最高。唯一例外的是泥炭作有机修复物的处理，其T-RFs数最高出现在粉粒中（表1）。涉及绿肥（G

27、M）和腐熟动物肥(AM)的处理表现出更高的细菌多样性，特别是粘粒中，相比于其他有机修复物。另外，GM中的沙粒表现出异常高的多样性，相比于其他处理中的沙粒。在几绿肥出处理的几个处理中，一些片段表现出远远更大的荧光信号。沙粒中检测的多数T-RFs表现出集中的荧光信号，片段大小组成有：39,60,62,66,81,194,197,205,208,212,223,228,231,253,290,294,297,304，以及379bp(表2，图1)。只有197bp（GM）,253bp(GM,AM),290bp(GM,AM,SS)三个T-RFs只在沙粒中发现。检测的大多数沙粒中的T-RFs也同样出现在粉粒

28、和粘粒中（表2）。一大部分（T-RFs）在粉粒和粘粒中发现，但没有出现在沙粒中。细菌中大小为76bp和311bp（均是休闲耕作，Fallow）的T-RFs至存在于（定殖于）粉粒中，很多T-RFs只发现于粘粒中。这里面有：140 bp (GM, AM, 和 SS), 233 bp (fallow, NoN), 242 bpfallow, NoN, Ca(NO3)2, GM, and AM, 284 bp (GM 和 AM), 332 bp (NoN,GM, AM, 及 peat), 404 bp (peat), 409 bp(SS), 以及 476 bp (SS).没有发现具体特定处理的T-RF

29、s。SS作为肥料的处理表现出很强的205bp的波峰在所有的颗粒级中，但是缺少在其他肥料处理中发现的101,220, 262, and 329 bp片段 。而且， 95, 236, and 242 bp的T-RFs在泥炭处理和SS处理中都没发现，尽管这些片段在其他处理中很丰富（表2）。在其他几个处理中发现的228, 231, and 294 bp的T-RFs在GM作为肥料处理中非常丰富。聚类分析反应了所有处理沙粒中的细菌群体的高相似性，只有SS处理的群落结构在聚类中没有体现出。包含沙粒微生物群落的聚类也包括了无氮处理中粘粒发现的细菌。第二簇类包含栖息于粉粒和粘粒中的细菌群落。SS处理相比于其他处

30、理，其细菌群落相当不同，在粉粒和粘粒中表现出高度相似性。3.2 序列分析及遗传进化分析排布我们获得了部分测序信息从AM处理的粘粒中得到的涵盖大约500bp的51 16S rRNA基因，在T-RFLP 分析中表现出最高的多样性。24h测序表现出与RDP数据库记录条目高相似性，其中30个序列表现出与NCBI数据库中存储的已知序列有至少95%的相似性（表3）。剩余的序列与已知的16S RNA基因，未描述的细菌分类成员以及有描述的分支很远的成员只有中等（90-94%）相关性。遗传进化分析反应出克隆物没有均等的干扰不同细菌分类。 属于Holophaga/Acidobacterium 分类的细菌占实验中克

31、隆的菌37%，27%可以分到高GC或者低GC革兰氏阳性菌。剩菌余的克隆菌属于 -,-, and -Proteobacteria（18%），Verrucomi-crobiales (12%), Flexibacter/Cytophaga/Bacteroides （4%），Planctomycetales（2%）。一个遗传进化树包含三个Holophaga/Acidobacterium簇类中人工培养的成员，本实验得到的序列，其他环境克隆菌如图3中展示的。因为这个进化树知识建立在部分测序，它展示的属于Holophaga/Acidobacterium簇类细菌的大量多样性，而不是确定的遗传进化关系。所有测

32、序的克隆菌的理论HaeIII-HhaI T-RFs 在T-RFLP分布图中可以看到。理论的T-RF132bp是唯一的例外，没有在T-RFLP 分析中检测到。几个序列表现出相似的T-RFLP大小（表4）。实验发现遗传进化和土壤中空间的位置的关系。一些细菌组，如Holophaga（全噬菌属 ）/Acidobacterium（乳酸杆菌属）簇类，大多数Prosthecobacter（突柄杆菌属 ）成员，是更小颗粒中主要的存在菌，而Proteobacteria（变形菌门）在各种颗粒中分布大致相当。4 讨论4.1 细菌与土壤颗粒级的联系几项研究报道，在更小的颗粒中的微生物生物量更高。我们的结果清楚了表明了

33、不仅生物量，还有细菌群落结构，深刻的被土壤颗粒大小影响，即更小颗粒比更大颗粒拥有更高的微生物多样性。粉粒和粘粒中更高的生物量可以归结于更高的微生物多样性，而不是特定物种的定殖。这一点通过在所有粒级中的几个T-RF波峰的相似的荧光密度表明。更细小的颗粒为微生物提供一个阻挡捕食者的保护性的微生境。近期，研究表明在水生环境中，捕食者的摄食规则可能是细菌群落组成的主要构建外力。本研究中，属于Proteobacteria亚门的-,-,的细菌被证明是耐摄食的菌群，主要归因是3- to 6-µm的棒体的构造，这个构造可能是超过了原声动物能摄食的细菌大小。另外，属于-Pro-teobacteria

34、及Cytophaga-Flavobacterium 簇类的丝状细菌被证明是抗摄食。而且，观察到Rhizobium leguminosarum免受土壤中原生动物摄食，这部分保护来自皂土粘粒的添加。在我们的试验中，微生动物的摄食可能表现出对沙粒中群落结构的的有选择性的压力。最丰富的T-RFs主要是从-Proteobacteria中得到的 ，我们假定，可能耐摄食性是沙粒中一些细菌群拥有高丰富度的原因。可能，更小颗粒中的提供的大量可利用的营养可能是更高细菌多样性的原因。根据van Gestel et al，微生物，有机质，粘粒的相互临近对微生物的生存来说是必要的，这个空间里的有机质，粘粒提供基质和营养

35、。更细小粒级中有机质和微生物的丰富度，似乎是聚合体形成的后果。聚合体伴随着特定有机质的分解形成。因此，沙粒中发现的T-RFs可能代表了那些更好适应有限营养条件，或者能利用更大范围基质的细菌菌种。他们可能能够降解来自植物材料初步降解的高分子，大分子有机分子。16S rRNA基因序列的遗传进化排布表明有非常丰富的-Proteobacteria，如 Sphingomonas (T-RF of 81 bp)及Rhizobium-Agrobacterium群的细菌。-Proteobacteria的一些成员利用大范围的基质，菌种Sphingomonas因为能够降解芳香族复合物而被特别认识。因为沙粒似乎更倾

36、向于被真菌定殖，沙粒里一些细菌可能竞争不过真核生物。更进一步的认为群落组成由氧气浓度决定，序列分析表明粘粒中有好氧细菌存在，还有严格厌氧细菌如梭状芽胞杆菌的存在，这表明大小小于2µm的颗粒为好氧和厌氧菌提供了小生境，然而更大的颗粒级被好氧微生物占据。最近，观察到土壤中由密集菌苔平板的粘粒聚合体构成的生物膜的显影,这些粘粒聚合体包含一种或多中细菌，层状硅酸以盐及铁氧化物颗粒。粘粒被细胞外的多糖基质聚在一起，排成窝状，被用作微生物的住所。这些粘粒窝曾经被提议作为土著细菌的最小限度的营养球，可能至少部分解释了更高微生物多样性在粘粒中的现象。Holophaga/Acidobacterium

37、门在来自AM处理粘粒里被分析的克隆菌中是最丰富的最多样性的群组。这种细菌组在其他土壤中也是优势菌种，本研究，Holophaga/Acidobacterium门主要定殖在粉粒和粘粒中。因为这菌门中包含Holophaga foetida, Geothrix fermetans, 以及作为至今唯一培养菌种的Acidobacterium capsulatum，自然中这些微生物的作用的信息还很少。另外，Verrucomicrobiales的菌种，表现出与Prosthecobacter很高的相似性，主要在粉粒和粘粒中发现。此菌种的一个特点是菌柄的构成，由窄的，细胞质含有的细胞壁延伸物组成。他们有了几个好氧异养细菌的优点，如加强的呼吸和营养的摄入，同样提高的固体基质附着力。而且，已知的Prosthecobacter门菌种只利用很窄范围的糖类作为他们唯一的碳源，这可以解释为什么它们在更小的粒级中生存。4.2 粒级中细菌对有机修复物的响应在以前的研究中，在Ultuna 长期田间施肥实验的不同处理的效果表现出了关于有机质循环非常