山西边城酒大曲中优势霉菌分离与形态鉴定

1、山西边城酒大曲中优势霉菌分离与形态鉴摘要：本研究对山西边城酒大曲样本进行初步分 离、纯化，获得2种霉菌：l1和l2o显微镜形态观察鉴定 发现：l1菌株的菌落颜色为灰黑色、有细长皱褶、形状不规 则、形态较大，l2菌株的菌落颜色为白色、菌丝呈放射状、 形态较大，且l1和l2都可看到帚状的分枝和膨大的胞子囊; 对2个菌株进行生理生化研究鉴定表明：利用氮源方面，两 个菌株在含有酵母粉和牛肉膏的培养基中生长较好；利用碳 源方面，2个菌株都能利用葡萄糖、半乳糖以及麦芽糖，但 是都不利用蔗糖。通过对边城酒的优势霉菌的检测，为边城 酒生产过程中综合质量的提高提供理论依据；为酒曲生产工 艺的改进提供理论基础。关

2、键词：边城酒；霉菌；酒曲；分离和鉴定中图分类号：ts262. 3文献标识码：a前言我国的酒类繁多，各具特色，并且我国酒文化的历史源 远流长、酿酒技术历史悠久，早在夏朝时期就有历史记载。酿酒的关键在于酒曲，酒曲可分为：麦曲、大曲、小曲、红 曲、魏曲1-2 o对于边城酒的相关研究可以提高边城酒的 生物营养价值，以及边城酒的综合质量3。1材料与方法1.1实验材料山西省大同市天镇县边城酒酒厂提供。1.2培养基的制备查氏基础培养基：硝酸钠3,磷酸氢二钾lg、氯化钾 0. 5g、蔗糖30g、琼脂15g、水il、ph4.7。在121°c下灭菌 30mino提供碳源培养基：葡萄糖、麦芽糖、硝酸钠lg

3、、磷酸氢 二钾1. 3g、磷酸氢二鞍0. 5g.硫酸钠0. 8g.水llo在121°c 下灭菌30mino提供氮源培养基：硫酸铁0.8,蛋白脓、酵母粉、硝酸 钠lg、亚硝酸钠lg、水1l。在121°c下灭菌30minopda培养基：（去皮马铃薯、琼脂、水、葡萄糖）；取去 皮处理干净的马铃薯200g,切成小块，加入水loooml后煮 沸30min左右，用多层纱布过滤，取滤汁，再依次加入琼脂、 糖分装于试管中。再在121°c下灭菌30mino麦芽汁琼脂培养基：（干大麦、水、琼脂）；取干净干大 麦泡在水中培养获得较长麦芽，把干麦芽捣碎糖化后过滤， 获得滤汁，再加入琼脂形

4、成培养基。再在121"下灭菌30mino麦芽汁液体培养基：（干大麦、水）；取干净干大麦泡在 水中培养获得较长麦芽，把干麦芽捣碎糖化后过滤，获得滤 汁，然后在121工灭菌30min,再进行分装，即可形成培养1. 3实验步骤 1.3. 1酒曲菌悬液的制备用电子天平准确称取3g由酒厂提供的酒曲样品，研磨 捣碎，放入有300ml的无菌蒸馅水的锥形瓶中摇匀510 min。再用5层纱布过滤，获得不含沉淀等杂质的清澈酒曲 菌悬液。分别配制出浓度为：10%、1%、0.1%、0.01%、0. 001%的无菌酒曲菌悬液。1. 3. 2涂布培养取5个无菌培养皿，都倒入温度冷却至5(tc左右的培养 基15n

5、il,取不同浓度梯度的无菌菌悬液0. lml依次加入到培 养皿中，用无菌涂布棒把菌悬液均匀，使得菌悬液在培养 基上均匀分布。然后，把以上培养皿都放在37x2恒温培养箱 中培养，观察菌落的形态和生长状况4。1.3.3菌种的分离纯化等待培养基上长出目的菌后，在无菌操作台中进行以下 实验：在pda培养基上培养接种的菌落约24h,观察菌落的 生长状况，重复上述无菌接种平板划线分离的方法直到在 pda培养基上生长出单一的菌落为止。一共获得2种纯化的 单一菌株，并且把这两种纯化的菌株进行编号：li、l2o再 把这2种编号的菌株再接种到pda培养基上，在37*恒温培 养箱中进行培养。1.3.4菌落的显微观察

6、在纯化的菌株生长24h后取出培养皿，用刀片切下小块 长有菌落的培养基放在载玻片上，再放在显微镜下进行观 察。并且把剩余的培养基继续放在恒温培养箱中培养，定期 取出，进行显微观察5。1.3.5霉菌的鉴定运用经典微生物分类的方法6对霉菌进行分类，根据 霉菌的生态学、形态学和生理学等特征对霉菌进行形态以及 生理生化方面的鉴定7。1.3.6 li、l2的生物特性1.3. 6. 1最适生长ph的测定准确配制ph为2、3、4、5、6、7、8、9的无菌麦芽汁 液体养基，在无菌操作台中，把lk l2分别用无菌接种的 方式接种到不同的ph培养基上，在37"的恒温培养箱中培 养，观察菌株的生长状况8。1

7、.3. 6.2最适生长温度的测定在无菌操作台中，用无菌接种的方式把li、l2分别接 种在相同情况的麦芽汁琼脂培养基上。把以上培养基再分别 放在温度设为 15°c、20°c、25°c、30°c、35°c、40°c、45°c、 恒温培养箱中进行培养，观察菌株的生长状况9。1.3. 6.3菌株对于碳源的利用把不含糖的查氏培养基作为基础培养基，依次在基础培 养基中加入麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等各种单 一糖类。在无菌操作台中，把li、l2分别接种到以上各个 培养基上，然后把所以上所有培养基都放在37*的恒温培养 箱中进行培养

8、，观察菌株的生长状况。1. 3. 6. 4菌株对于氮源的利用把不含糖的查氏培养基作为基础培养基，依次在基础培 养基中加入尿素、硝酸钠、亚硝酸钠、牛肉膏、酵母粉、蛋 白豚等各种单一氮源。在无菌操作台中，把li、l2分别接 种到以上各个培养基上，然后，把以上所有培养基都放在 37的恒温培养箱中进行培养，观察菌株的生长状况 10-11o2实验的结果与分析2.1霉菌的形态观察与鉴定结果2. 1. 1霉菌菌落形态观察结果2. 2.4氮源的利用li、l2都可以利用尿素、硝酸钠、亚硝酸钠、牛肉膏、 酵母粉、蛋白腺。并且，li、l2在尿素、牛肉膏、酵母粉、 蛋白豚中长势最好；在硝酸钠和亚硝酸钠中长势一般。总之

9、, li、l2都能利用不同的氮源。因此，氮源的利用不能作为区 分鉴定菌株li、l2的一项生理生化指标。3结论与讨论3. 1结论这次试验通过对山西边城酒的酒曲进行酒曲悬液的制备、涂布培养、菌种的分离纯化、显微镜的观察、霉菌的鉴 定以及菌种生理生化方面的初步鉴定。我们可以获得2种菌 株li、l2。研究这两个菌株的形态特征和生理生化方面的特 点，li、l2的菌落形态都与霉菌的菌落非常的相似，最适生 长ph都在46之间，最适生长温度都在354(tc之间，都 可以利用麦芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖，都不利用蔗糖， 对于氮源方面的利用没有太大的差异。3.2讨论现今为止，我国对于山西边城酒的研究报道非常的少。

10、 这个研究课题的提出，有助于引起人们对于这个方面的兴趣 以及使人们对山西边城酒有了 一定初步的了解。此外，这个试验是对酒曲中霉菌的初步研究和鉴定，它 不同于传统的对白酒的酿造过程主要是微生物的发酵方面。这个试验对酒曲中的微生物细化到了单一的霉菌，通过对单 一霉菌的生理生化方面的初步鉴定，有助于后期霉菌分子生 物学方面的研究，从基因的水平，对酒曲微生物进行定性和 定量的研究，对其霉菌的遗传方面等方面都有很大的帮助， 同时，为边城酒生产过程中综合质量的提高提供理论依据;为酒曲生产工艺的改进提供理论基础。参考文献1 施安辉浓香型白酒发酵过程中微生物区系的分析j.酿酒，1986 (4)：24-29.2

11、 傅金全中国酒曲技术的发展与展望j.酿酒，2002, 3 (2)：7-9.3 王佳丽，韩建荣，赵景龙.汾酒大曲中红曲霉的分离和鉴定j.山西大学学报，2009 (2)：289-293.4 沈萍.微生物实验m.北京：高等教育出版社，1999, 3 (1)：5-6.5 中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定m.北京：科学出版社，1978, 4 (4)：1-2.6 王大粘细菌分类基础m.北京：科学出版社，1977, 3 (8)：7-8.7 范秀荣，李广武，沈萍微生物学实验(第3版)m.北京:高等教育出版社，1999：214-215.8 魏培莲，周立平，徐辉红曲霉菌株生物学特性的研究j.浙江科技学院学报，2002, 14 (3)：12-15.9 郭红珍.山西老成醋大曲红曲霉分离鉴定j.中国食品添加剂，2006 (3)：2-4.10 hawksworth d l, pittj. a new taxonomyformonascus species based onthe culturalandmicroscopical characters j i.aust j bot, 1983,31：5