干扰素生物活性两种测定方法比较探究

1、干扰素生物活性两种测定方法比较探究摘要目的:摸索改进的结晶紫染色法与嘍呼蓝(mtt)比 色法中哪一种方法能够提高干扰素的生物学活性测定(细胞 病变抑制法)结果的准确性。方法:比较在干扰素的生物学活 性测定后期，采用先结晶紫染色乙醇脱色然后比色的方法(方 法一)和采用加入mtt后裂解比色的方法(方法二)，经过多次 比较证明哪一种方法测定结果的准确性更高。结果:采用方法 二测得的多次结果之间产生的偏差较小，单次结果的可信度 较高，单次测定结果的相关系数r值较大。结论:采用mtt比 色法比改进的结晶紫染色法更适合应用于干扰素的生物学 活性测定，可提高结果的准确性。关键词干扰素;生物活性;结晶紫染色法

2、;mtt比色 法;wish细胞中图分类号r-331文献标识码a 文章编 号1673-7210(2010)04(a)-036-03comparative study on the two methods for detecting bioactivity of interferonzhao hong(beijing sl pharmaceutical co., ltd, beijing 100041,china)abstract objective: to improve the accuracy of bioactivity detection (cytopathic effect inhib

3、itory method) of interferon by comparing the crystal violet staining and mtt colorimetry. methods: in the late stage of bioactivity detection, the first method (first staining by crystal violet, then discoloring by alcohol, at last colorimetry) and the second method (first adding mtt solution, then

4、adding cell lysis solution, at last colorimetry) were compared by experiments for many times to investigate which method had a higher accuracy in the detection results. results: compared with the first method, the outcome bias of the second method was smaller, the reliability was better, and the rel

5、ated coefficient (r) of single experiment was higher. conclusion: mtt colorimetry is better than the crystal violet staining in applying to detect bioactivity of interferon.key words interferon; bioactivity; crystal violet staining; mtt colorimetry; wish cells干扰素(interferon,ifn)第一个被发现的细胞因子，也是第一个应用于临

6、床的基因工程产品。根据其来源、理化性质、 氨基酸序列和生物学活性的不同,可分为cl队丫三种类型。 ifn的作用具有种属特异性，其主要功能有抗病毒、抗肿瘤、 增强nk、tc细胞的活性及进行免疫调节等多种生物学活性, 是一类重要的细胞因子。通常干扰素生物活性测定方法是采 用中国药典三部附录xc细胞病变抑制法（结晶紫染色法, 方法一）。由于日常实验中发现生物活性测定曲线不理想，重 复性较差，故对其操作进行一些改动，同时考虑到该实验中间 操作较多，容易引入操作误差，故探讨一种中间操作少的方法, 以减少实验误差，提高实验结果的准确性。mtt比色法（方法 二）广泛应用于细胞生物活性检测，故笔者旨在通过本实

7、验证 实改进的结晶紫染色法与mtt比色法哪一种方法更适合用 于干扰素生物活性的测定，得到更为准确的实验结果，为干扰 素的临床应用提供有力的保证。1材料与方法 1.1原理1.1.1方法一原理根据干扰素能刺激某些指示细胞，如人 羊膜上皮细胞（wish细胞）、人喉癌细胞（hep2细胞）、人胚 肌皮细胞和肺单层细胞（2bs细胞）等，产生抗病毒蛋白，使细 胞免受牛水泡性口炎病毒（vsv）的攻击。根据待测样品干扰 素不同稀释度的保护能力，计算出干扰素的生物活性单位。1.1.2方法二原理mtt比色法的基本原理是活细胞线粒体中富含琥珀酸脱氢酶,氧化型mtt进入细胞后可被该酶还 原生成蓝色form aza n颗

8、粒，沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后比色定量,其颜色深浅直接与活细胞数有关。1.2实验试剂、材料与实验器具1.2.1 dmem培养液取dmem培养基粉末1袋（gibco公 司,规格为1 l,批号31600-034）,加水溶解并稀释至1 000 ml, 加青霉素1.0x105 u和链霉素10.x105 u,再加碳酸氢钠2.0 g、l谷氨酰胺 0.292 3 g（sigma 公司，批号 g3126）. hepes 2.838 g（amersco公司）溶解后，混匀，过滤除菌,49保存。1.2.2基础培养液（10%）取新生牛血清10 ml（四季青生物公司，批号064202）,加dmem培养液至10

9、0 ml,4°c保存。1.2.3测定培养液（7%）取新生牛血清7 ml,加dmem培养液至100 ml,4°c保存。1.2.4攻毒培养液（2%）取新生牛血清2 ml,加dmem培 养液至100 ml,4°c保存。1.2.5消化液0.5%胰蛋白酶消化液：002%edta=1:1（0.5%胰蛋白酶及0.02% edta均用pbs溶液配制）。1.2.6染色液结晶紫染色液（0.1 g+20 ml无水乙醇溶解后加水至100 ml）o1.2.7脱色液50%无水乙、50%蒸憎水及0.1%乙酸。1.2.8细胞wish细胞。1.2.9vsv-70°c 冻存。1.2.10裂

10、解液取十二烷基硫酸钠（sds,分析纯）15 g,用 适量蒸憎水和50 ml dmf（n,n-二甲基甲酰胺）溶解,加蒸馆水至100 ml,用盐酸调节ph至4.7oll!1.2.11 mtt溶液取05g mtt,加pbs溶解成100 ml,配制成0.5% mtt溶液，经0.22 pm滤膜过滤除菌。49避光保存。1.2.12 pbs溶液取8 g氯化钠、0.2 g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24 g磷酸二氢钾加蒸馆水配成1 000 ml溶液, 121°c 15 min高压灭菌。1.2.13干扰素a活性测定国家标准品批号97/04,-209 贮存,7 500 iu/支。1.2.14器材9

11、6孔细胞培养板若干个，百级工作台，二氧化 碳培养箱（三洋公司），酶标仪（molecular devices公司），生物 倒置显微镜（coic,重庆光学仪器厂），单道微量移液器,8道微 量移液器，无菌1.5 ml塑料离心管和200 pl、1 ml tip头若干。1.3测定法（以下操作均为无菌操作）1.3.1方法一1使wish细胞在培养基中贴壁生长，按 1:21:4传代，每周23次，于完全培养液中培养。轻摇 wish细胞，弃去培养瓶中的培养液，用pbs溶液洗2次后加 消化液（0.5%胰蛋白酶消化液:0.02% edta=1:1,即1.5ml:1.5 ml）消化，镜下观察消化程度，见镜下大部分细胞离

12、散 后，吸弃消化液，立即加5 ml 10% dmem培养液，终止消化反 应，用10 ml移液管用力吹打将细胞吹散，镜下观察大部分细 胞呈单个细胞，用10% dmem培养液配成30切05个/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板中，每孔100 pl,37°c,5%co2条件下培养46 ho标准品溶液的配制:取1支干扰素活性测定国家标准品,按使用说明书复溶后，用7% dmem培养液稀释至1 000 iu/ml（ifn国家标准品直接加7% dmem培 养液220 pl稀释）。在96孔培养板中，以4倍稀释度做梯度稀释（50 pl+150 pl）,共8个稀释度,每个稀释度做2个复孔。供试品溶液的配

13、制:将供试品按标示量复溶后，用7% dmem培养液稀释成约1 000 iu/mlo在96孔培养板中，以4倍稀释度做梯度稀释，共8个稀释度，每个梯度做2个复孔。将 项配制的标准品溶液和供试品溶液加入接种wish细胞的培 养板中，每孔100 m于37°c、5% co2条件下培养1824ho 制备病毒液与攻毒:取-709冻存的vsv用2% dmem攻 毒培养液稀释至100tcid50o吸弃细胞培养板的上清，将稀 释好的病毒液加入培养板中，每孔100 pl,379、5%co2培养 24 ho镜检标准溶液的50%病变点在1 iu/ml,即为f行。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入50 pl

14、结晶紫染色 液，室温放置30 min后，用水盆盛上纯化水，换水漂洗培养板3 次，并在吸水纸上轻叩几下,然后每孔加入100 pl脱色液，室温 放置5-10 mine用微量振荡器振荡混匀1 2 min,然后于波 长540 nm处测定。根据样品稀释倍数计算实验测定结果。1.3.2方法二口-3此方法中与方法一中相同。每 孔加入0.5% mtt溶液20 pl,于379、5% co2条件下培养 5 h,然后每孔加入100 pl裂解液，于379、5% co2条件下 培养过夜，用微量振荡器振荡混匀12 min,然后于波长540 nm处测定。根据样品稀释倍数计算实验测定结果。2结果2.1方法一测定结果见表1o

15、表1方法一测定结果(107 iu/ml)方法一总平均值为1.916x107 iu/ml,所有测定值间的rsd 为 15.0%02.2方法二测定结果见表2o表2方法二测定结果(107 iu/ml)方法二总平均值为1.887x107 iu/ml,所有测定值间的rsd 为 11.8%o2.3方法一每次测定的r值 见表3o表3方法一每次测定的i值2.4方法二每次测定的r见表4o表4方法二每次测定的r值3讨论由表仁2可以看出，两种方法平均值偏差不大，方法一单次测定结果之间偏差较大值较小;方法二单次测定结果之 间偏差较小,r值较大。由此可以看出，方法二测定的结果准确 性较高。实验所用wish细胞株的生长状态、铺板细胞数目、vsv 滴度以及病变终止时间的确定等因素都会影响实验结果，尤 其是病变终止时间的确定存在个人主观偏差。为了保证实验 结果的良好重复性,需要严格保持实验条件的一致性。目前测定干扰素活性更为灵敏的方法还有elisa检测法和ldh释放法45等,更为客观的方法正在摸索中，希望不久 能够建立更为灵敏的检测方法。参考文献口国家药典委员会冲国药典s.三部北京:化学工业出 版社,2005:附录56-57,附录59.黄志