琼脂稀释法操作步骤PPT课件

1、原理：原理： 将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128g/ml 、64g/ml 、32g/ml 0.06g/ml对倍稀释的浓度系列 多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点种到琼脂表面,经3516-20小时培养 肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)第1页/共27页 抗菌药物保存液的准备抗菌药物保存液的准备1 1估算抗菌药物最小称量估算抗菌药物最小称量琼脂稀释法最高药物浓度为128g/ml药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成15倍稀释，因此保存液为 128g/ml15 = 1920g/ml如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/m

2、l*10ml抗菌药物的效价第2页/共27页抗菌药物保存液的准备抗菌药物保存液的准备2 2抗菌药物稀释抗菌药物稀释选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,稀释液需要量见下列公式：稀释液体积=抗菌药物实际称量*效价保存液浓度（1920ug/ml）第3页/共27页 抗菌药物保存液的准备抗菌药物保存液的准备3 3实际操作：实际操作：先计算完成一批试验需几次完成,每次用量多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药物名称,浓度,体积数及配制日期,置与-20保存,备用。第4页/共27页培养基培养基需氧菌MH肉汤或琼脂苛氧菌嗜血杆菌属：Haemophilus test med

3、ium base +补充因子SR158链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维羊血淋球菌：CC Agar Base+L53厌氧菌Wilkins chalgren anaerobe 琼脂第5页/共27页菌液准备菌液准备1 1生长法：生长法：无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落顶部后接种于4-5mlMH肉汤内35 培养4-6小时到对数生长期，亦可过夜培养,但不允许超过18小时用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml第6页/共27页菌液准备菌液准备2 2直接菌落悬浮法：直接菌落悬浮法： 从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用无菌环取单个

4、菌落 接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS第7页/共27页菌液准备菌液准备3 3对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直接菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液,应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10稀释,此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调整好的菌液应该在制备后的15分钟内完成点种第8页/共27页菌液准备菌液准备4 4如一次实验需完成50株或100株细菌,则细菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种编号第9页/共27页琼脂稀释法药敏平板的制备琼脂稀释法药敏平板的制备 1 1配制融

5、化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、厌氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到48-50，浇制药物平板。取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平板底部作好“点种标记”、“药物名称”、“药物浓度”,浓度从0.06g/ml128g/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。第10页/共27页琼脂稀释法药敏平板的制备琼脂稀释法药敏平板的制备2 2取11支无菌玻璃试管(13100mm),每支试管标记为：960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.875,0.935g/m,并于上述每根管子中用无菌移液管加无菌稀释液1.5ml第11页/共27页琼脂稀释法药敏平板的制备琼脂稀释法药敏平板的制备3

6、 3将保存在-20冰箱中的1920g/ml浓度的抗菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取2.5ml加入到128g/ml标记的平板内1ml移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内,混匀后再吸取2.5ml加入到64g/ml标记的平板内1ml移液管内剩余的1.5ml再加入到480g/ml标记的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml依次类推,直至最后一个0.06g/ml标记的平皿内加入1ml,则抗菌药物稀释完成第12页/共27页琼脂稀释法药敏平板的制备琼脂稀释法药敏平板的制备4 4准备2只无药的平板,作点种前和点种后质控对照所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉眼可见的水珠(可在35孵箱内倒置平板

7、开盖烘干15-20分钟) 第13页/共27页琼脂稀释法药敏平板的制备琼脂稀释法药敏平板的制备5 5如果需使用的药物平板为100100mm的方平板,则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻璃试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml 第14页/共27页测试菌液的点种测试菌液的点种1 1 预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干（52孔、100孔、或21孔） 将已调整好浊度(1-2107CFU/ml)的菌液用微量加样器将菌液依次加入菌液点

8、种板小孔内,并作好与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入菌液270l。每批试验均须保留有质控菌位置和无菌菌液位置 用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置上多点接种器的点种板位置上第15页/共27页测试菌液的点种测试菌液的点种2 2 开启多点接种器进行点种，因每一根点种针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点的菌液量约为2l，所以接种量为104 CFU/点 点种时应先点种对照前的质控平板，然后从最低药物浓度开始点种依次点种到药物浓度最高的平板第16页/共27页第17页/共27页第18页/共27页第19页/共27页药物平板的孵育药物平板的孵育 上

9、述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于35孵育16-20小时 如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35，绝对不能超过35，孵育24小时，阅读结果 万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24小时后，阅读结果 淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小时，阅读结果第20页/共27页结果阅读和判断结果阅读和判断 结果阅读时，平板应置于黑色不反光的表面上，记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度，单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象可忽略不计。 如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落，或者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的跳管现象

10、，就应该检查试验菌的纯度，有否污染菌生长，并尽可能重复试验。 按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果。第21页/共27页质质 控控 菌菌 株株质控菌株药敏其他金黄色葡萄球菌ATCC29213+大肠埃希菌ATCC25922+大肠埃希菌ATCC35218+产内酰胺酶肺炎克雷伯菌ATCC700603+产超广谱内酰胺酶铜绿假单胞菌ATCC27853+第22页/共27页质质 控控 菌菌 株株质控菌株药敏其他肺炎链球菌ATCC49619粪肠球菌ATCC29212+检测胸腺嘧啶流感嗜血杆菌ATCC49766+氨苄西林敏感株流感嗜血杆菌ATCC49247+产内酰胺酶(-)氨苄西林耐药株淋病柰瑟球菌：ATCC49226+厌氧菌ATCC25285+第23页/共27页常见问题及解决指南常见问题及解决指南抗菌药现象可能原因解决办法氨基糖苷类