培养基及其配制

1、第3章 培养基及其配制讲授：白凤麟 2013.09.26培养基的种类培养基的种类培养基的组成培养基的组成培养基的配制培养基的配制 本章主要内容培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基一一、培养基的种类二、培养基的组成二、培养基的组成 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面

2、的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。培养基组成培养基组成无机营养成分+有机营养成分=基本培养基Arnon和和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元）提出的确定植物必需营养元素的素的3个标准个标准A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史。B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复。C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、

3、Cl、（Ni） 在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上； 9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg 7种按照国际植物生理协会的建议：按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为大量元素的元素为大量元素 所需浓度所需浓度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素为微量元素的元素为微量元素1、大量元素、大量元素N N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成

4、成分，在植物生命活动中脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。占有重要的位置。 P P是磷脂的主要成分。培养基中常用是磷脂的主要成分。培养基中常用KHKH2 2POPO4 4 NaHNaH2 2POPO4 4等。等。 K K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。有密切关系。MgMg、S S、CaCa是叶绿素的组成成分，又是激酶的是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S S是含是含S S氨基酸的蛋白质的组成成分。氨基酸的蛋白质的组成成分。CaCa是构成细胞壁的成分，对

5、细胞分裂，稳定质是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，膜结构有显著作用，此外，CaCa及钙调素在细胞及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。信号转导中起重要作用。2、微量元素、微量元素 在微量元素中，在微量元素中，铁铁的使用最大的使用最大 ： 一些氧化酶的组成成分一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-FeEDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀鳌合物防止铁的沉淀 硼硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生是某些氧化酶的成分，能够

6、促进离体根的生长长 锰锰参与植物的光合、呼吸代谢参与植物的光合、呼吸代谢 钼钼参与氮素的代谢参与氮素的代谢 氯氯是光合作用水光解的活化剂是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂酶的辅助因子或激活剂参与参与代谢的调节。代谢的调节。 缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。 桃树桃树缺铜症状：缺铜症状： 新梢顶端叶片的叶尖失绿新梢顶端叶

7、片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。扩大变成深褐色，引起落叶。 枝顶端生长不良，其下部枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的的芽开始生长，形成丛生的细枝。细枝。 菊花菊花缺锰典型症状：缺锰典型症状： 叶脉间失绿褪色，但叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。由幼叶开始。 菜豆菜豆缺钼典型症状：缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿叶较小，叶脉间失绿,有坏有坏死斑点，且叶边缘焦枯，死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，

8、老叶变厚且枯卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。焦。 白菜白菜缺硼典型症状：缺硼典型症状： 受精不良受精不良,籽粒减少籽粒减少 ，“花而不实花而不实”， “蕾而不蕾而不花花”； 根尖、茎尖的生长点停止根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；生长，而形成簇生状； 常引起各种腐烂病。常引起各种腐烂病。 马铃薯马铃薯3、碳源、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以酸，以糖类糖类物质最重要。物质最重要。 糖类物质特点：糖类物质特点： 具有热易变的性质具有热易变的性质 利于吸收和利用利于吸收和利用 使用浓度一般在使用浓度一般在2%2%5%5% 提供能源和调节渗透压提

9、供能源和调节渗透压4、维生素类、维生素类 以各种以各种辅酶辅酶的形式存在的形式存在 参与多种代谢活动参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为主要分为脂溶性维生素脂溶性维生素和和水溶性维生素水溶性维生素 常用维生素有常用维生素有V VB1B1和和V VB6B6 5、肌醇、肌醇 环己六醇环己六醇 细胞壁的构建材料细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动生理活动 促进活性物质发挥作用促进活性物质发挥作用6、氨基酸、氨基酸 蛋白质的组成成分蛋白质的组成成分 有机氮源有机氮源 可直接被细胞吸收利用可

10、直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是培养基中常用的是甘氨酸甘氨酸7、天然复合物、天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂化学成分不明、复杂 天然营养混合物天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、琼脂、琼脂 是使用最普遍的凝固剂是使用最普遍的凝固剂用量一般在用量一般在6 610g/L10g/L之间之间颜色以浅、透明度高好，颜色以浅、透明度高好，洁净为上品洁净为上品 除了琼脂外，在组织培除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。冷胶等。9、活性炭、活性炭 吸附培养基及

11、培养物分泌物中的抑制物质吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化促进培养物生长和分化 促进生根促进生根缺点：缺点： 没有选择性没有选择性10、抗生素、抗生素 防止外植体内生菌造成的污染防止外植体内生菌造成的污染活性炭活性炭11、生长素类、生长素类 促进细胞伸长和分裂促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成诱导愈伤组织形成 溶于溶于95%95%酒精或酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的Na

12、OHNaOH中，后者的中，后者的溶解效果更好溶解效果更好 常用的生长素：常用的生长素： IAA(IAA(吲哆乙酸吲哆乙酸) ) NAA ( NAA (奈乙酸奈乙酸 ) ) 2,4-D( 2,4-D(二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸) ) IBA( IBA(吲哆丁酸吲哆丁酸) )生长素作用强弱顺序：IAANAAIBA2,4-D强强弱弱2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根12、细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控 溶于0.51.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素： KT (激动素) BA(6-

13、卞基腺嘌呤) ZT(异戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素类和脱落酸 A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力14、水作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。切代谢过程的介质和溶媒。 注意：注意：用蒸馏水，最好是双蒸水；以保持用蒸馏水，最好是双蒸水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。自来水。1、MS培养基培养基 无机盐浓度高无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐高含量的氮

14、、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐含有一定数量的铵盐 营养丰富营养丰富 不需要添加更多的有机附加物不需要添加更多的有机附加物（一）、几种常见培养基的特点（一）、几种常见培养基的特点（二）、（二）、White培养基培养基 19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计为培养番茄根尖而设计 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSOMgSO4 4的浓度和增加硼元素的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低无机盐浓度较低 使用广泛使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果（三）、（三）、B5培养基培养基 19681968年由年由Gamb

15、orgGamborg等为培养大豆根细胞等为培养大豆根细胞而设计而设计 含有较低的铵盐含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素较高的硝酸盐和盐酸硫胺素（四）、（四）、N6培养基培养基 19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计养设计 AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现浓度：1-10mg/L抗生素：抗生素：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。作用：可防止外植体内生菌污染。浓度：520mg/L。1、 母液母液(stock solution)的配制和保存的配制和保存v所谓所谓母液母液是欲配制液的是欲配制液的浓缩液浓缩液。v意义意义: 保证各

16、物质成分的准确性保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取配制时的快速移取 便于低温保藏。便于低温保藏。三、三、 培养基的配制培养基的配制单配法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用度的母液。一般用mg/ml 。混配法：混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。数称量，分别溶解后再混合成母液。母液配制时可分别配成母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等铁盐、有机物和激素类等 母液的配制方法：母液的配制方法： 培养基母液

17、的配制 母液名称母液名称 药品药品 名称名称 大量元素（大量元素（MSI） NH4NO3KNO3CaCl2H2OMgSO4 7H2OKH2PO4微量元素（微量元素（MSII） MnSO4H2OZnSO47H2OCoCl6H2OCuSO45H2OH3BO3Na2MO42H2OKI铁盐（铁盐（MSIII） FeSO47H2ONa2-EDTA2H2O有机物（有机物（MSIV） 烟酸烟酸(Vpp)盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素盐酸硫胺素甘氨酸甘氨酸肌醇（肌醇（MSV） 肌醇肌醇vMS母液配制：vMSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII铁 盐 200X MSIV有机 物 20

18、0X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/mlMS(大量元素大量元素)配方用量配方用量mg/L20X（mg）称量称量1.NH4NO316503300033g2.KNO319003800038g3.CaCl22H2O 44088008.8g4.MgSO4 7H2O 37074007.4g5.KH2PO4 17034003.4g将将1、2、4、5称好放入烧称好放入烧杯分别溶解混杯分别溶解混合，将合，将3最后最后混合，再定容混合，再定容到到1L，放入试，放入试剂瓶贴标签，剂瓶贴标签，备用备用500mL甲甲1、2、4、5500mL乙乙3 定容定容贴标签贴标签1L MS X20 2013.9.2

19、6 HXH注：注： Ca2+和和S042-混合后易沉淀。混合后易沉淀。MS (微量元素微量元素)配方用量配方用量mg/L200X（mg）称量称量(g)1.KI0.831660.1662.H3BO46.212401.243.MnSO44H2O22.344604.464.ZnSO47H2O8.617201.725.Na2MoO42H2O0.25500.056.CuSO45H2O0.02550.0057.CoCl26H2O0.02550.005将将17称好放入烧杯分称好放入烧杯分别溶解混合，定容到别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备放入试剂瓶贴标签，备用用1000mL17 定容定容贴标签贴标

20、签1L MS X200 2013.9.26 HXHMS (铁盐铁盐)配方用量配方用量mg/L200X（mg）称量称量(g)1.FeSO47H2O27.855605.562.Na2EDTA2H2O37.374607.46将将1称好放入称好放入烧杯甲溶解，烧杯甲溶解，将将2放入烧杯放入烧杯乙溶解，再混乙溶解，再混合定容到合定容到1L，放入试剂瓶贴放入试剂瓶贴标签，备用标签，备用1L500mL甲甲1500mL乙乙2混合定容混合定容贴标签贴标签 MS X200 2013.9.26 HXHMS (有机物有机物)配方用量配方用量mg/L200X（mg）称量称量(g)1.烟酸烟酸0.51000.12.盐酸吡

21、哆醇盐酸吡哆醇0.51000.13.盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1200.024.甘氨酸甘氨酸24000.4将将1、2、3、4称好放入烧称好放入烧杯分别溶解混杯分别溶解混合，定容到合，定容到1L，放入试剂瓶贴放入试剂瓶贴标签，备用标签，备用1000mL14 定容定容贴标签贴标签1L MS X200 2013.9.26 HXHMS配方用量配方用量mg/L200X（mg）称量称量(g)1.肌醇肌醇1002000020将肌醇称好放将肌醇称好放入烧杯溶解定入烧杯溶解定容到容到1L，放入，放入试剂瓶贴标签，试剂瓶贴标签，备用备用1000mL1溶解定容溶解定容贴标签贴标签1L MS X200 2013.9.2

22、6 HXHv母液配制时应注意事项：母液配制时应注意事项：母液配好后放人冰箱内母液配好后放人冰箱内低温保存低温保存（4），用时），用时再按比例稀释。再按比例稀释。其中其中III、IV、以及激素类物质应以、以及激素类物质应以棕色瓶棕色瓶盛装。盛装。母液母液使用前摇动瓶子使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用生物污染应停止使用取样时移液管要取样时移液管要对应取样，对应取样，防止交叉污染防止交叉污染化合物名称化合物名称MS(1962)White(1943)N6(1974)B5(1968)Heller(1953)Nitsh(1972)Miller(1967)SH(1

23、972)NH4NO31650 7201000 KNO319008028302527.5 95010002500(NH4)2SO4 463134 NaNO3 600 KCl 65 750 65 CaCl2 2 H2O440 16615075166 200Ca(NO3)2 4H2O 300 347 MgSO4 7H2O370720185246.525018535400Na2SO4 200 KH2PO4170 400 68300 K2HPO4 300FeSO4 7 H2O27.8 27.8 27.85 15Na2-EDTA37.3 37.3 37.75 20Na-Fe-EDTA 28 32 FeCl

24、3 6H2O 1 Fe(SO4) 3 2.5 MnSO4 4 H2O22.374.4100.01254.4 ZnSO4 7 H2O8.631.521101.5 Zn (螯合体螯合体) 0.03 10NiCl2 6H2O 1.0CoCl2 6 H2O0.025 0.025 0.025 CuSO4 5H2O0.025 0.0250.03 AlCl3 0.03 MoO3 0.25 Na2MoO4 2 H2O0.25 0.25 TiO2 0.81.0KI0.830.750.80.750.01101.65.0H3BO36.21.51.631 NaH2PO4 H2O 16.5 150125 烟酸烟酸0.5

25、0.50.51 5.0盐酸吡哆素（盐酸吡哆素（VB6）0.50.10.511.0 5.0盐酸硫胺素（盐酸硫胺素（VB1）0.10.1110 0.5肌醇肌醇100 100 100 100甘氨酸甘氨酸232 2、培养基的配制：MSBA2NAA0.2糖3.0琼脂0.7 pH=5.8 MS：MS I 50 mlMS II 5 mlMS III 5 mlMS IV 5 mlMS V 5 ml BA：20ml; NAA：2ml 糖：30g; 琼脂：7gV贮备液用量贮备液用量V V配制配制/ /浓缩倍数浓缩倍数V V激素贮备液激素贮备液 C激素激素*V V配制配制/0.1/0.1mg/mlmg/ml培养基的选择v培养基基本培养基培养基基本培养基 植物激素植物激素 v培养基的选择在实质上讲就是设计营养物培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合。质与激素（种类、用