微生物种群鉴定

1、微生物鉴定的目标是什麽种属？样本中有无目标微生物？目标微生物定量；种群比例；微生物亚型；菌群中各种微生物比例变化；菌种改良微生物鉴定的技术发展形态和培养；生理生化：营养、代谢、酶谱等；免疫学：血清学、胶体金、ELISA;细胞壁成份：脂肪酸等；DNA杂交；PCR、RFLP、RAPID、AFLP、PFGE等；测序技术；实时定量PCR技术；芯片技术、质谱等传统方法-1形态和培养优点： 缺点：1.简便； 1.时间很长；2.能够鉴别的种类很少；2.简单计数； 3.依靠经验；4.大致分类；传统方法-2 生理生化营养：碳源、氮源利用；糖酵解、淀粉水解、明胶水解等代谢：显色反应；V-P，甲基红、吲哚、H2S等

2、；酶：酶谱分析；传统方法-2 生理生化-设备传统方法-3 免疫学传统方法-4 细胞壁组份MIDI传统方法的流程取样富集单菌落初分类鉴定相似性分析选择鉴定板传统方法的缺陷流程相对复杂，耗时长，3天以上；每次鉴定一个细菌；必须是单菌落，不能直接做混合样本；相似性分析，鉴定不够准确，无法到种、亚种；成本高，尤其是做种群；无定量，无法做种群比例变化；可鉴定钟内少，约3000种；分子鉴定基因组DNA多态性；PCR, RAPID-PCR, RFLP,AFLP,PFGErRNA操纵子分析：指纹图谱、定量PCR、测序分子鉴定-基因组多态性PFGEAFLPRAPID分子鉴定-基因组多态性设备基因组多态性优缺点快

3、速，成本低，灵敏度高；直接鉴定混合样本，未知鉴定和目标鉴定均可；通量高，每次几十样本以上；无定量；只有种群种类变化，无丰度变化；比对分析；分子鉴定- rRNA操纵子分析16s： 细菌种属的保守序列； 18S rRNA ：真菌类 Spacer region & 5s：多态性、亚型 23s： 决定细菌抗性、亚型等；分子鉴定- rRNA操纵子分析目前GeneBank等数据库中拥有全序列和rRNA序列的近万种分子鉴定- rRNA操纵子分析RT-PCR鉴定原理535535RQExtension complete probe is removedFluorescent signal intensi

4、ty is proportional to amount of amplicon produced.引物设计/BLAST/Blast.cgi激发和检测CFX96 FAST Real-Time PCRTop viewRT-PCR鉴定特点-准确药厂生产区域18种微生物分型鉴定准确性和重复性MicroSeqTM System100%100%iQ5TM TaqMan 98%100%RiboprinterTM System81%97%SherlockTM System50%81%MicrologTM Indentification65%62%Vitek

5、TM System33%89% 0-2hrs 1.5hrs 1.hrs 3hrs一般不需要增菌一般不需要增菌 RT-PCR RT-PCR鉴定特点-快速108106102104RT-PCR鉴定特点鉴定特点-定量定量RT-PCR鉴定特点-高通量炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的检测BA1pXO2 BA2pXO1 BA316srRNA同时鉴定种属同时鉴定种属以及亚种以及亚种特异性阳性样本：317个菌株来源于2001年爆发的炭疽事件27个临床样本、4个粉末样本、286环境样本阴性样本(144)p56个菌株：芽胞杆菌属其它5种杆菌：枯草杆菌芽胞杆菌（10）蜡状芽胞杆菌（23）苏云金芽胞杆

6、菌（12）覃状芽胞杆菌（1）巨大芽胞杆菌（10）p88个环境、临床样本炭疽检测特异性阳性样本（317）：3个靶位点100%阳性阴性样本（144）：3个靶位点100%阴性酿酒微生物种群-茅台为例地区环境主要微生物：约147种，细菌53种、酵母11种、霉菌49种、放线菌34种。主要细菌：肠杆菌、球菌、链球菌、黄杆菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌；霉菌：青霉、绿霉、黄曲霉、毛霉、梨头霉、根霉、曲霉、红曲霉等。发酵过程微生物：97种微生物。其中，细菌40种、酵母18种、霉菌35种、放线菌有4种。其细菌主要是枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，酵母主要是酒精酵母、假丝酵母、丝孢酵母、汉逊酵母、异常汉逊酵母、毕

7、赤酵母等，霉菌主要为温特曲霉、紫红曲霉、红色红曲霉 。 不同酒发酵微生物区别种群比例和数量的区别；各微生物种类生长曲线的差异；少数微生物种类的差异，如：嗜热芽孢菌RT-PCR一次提取DNA检测多个指标种群及数量-稠酒米根霉 CT = 20.3毛霉 CT = 22.8酵母 CT = 17.1枯草 CT = 18.7对照 CT = 21.3种群生长曲线-太白上中层酒醅4d：酵母菌、霉菌、放线菌增殖迅速；7d：芽孢菌急剧增殖，酵母菌、霉菌减少；18：酵母菌、霉菌均急剧减少，芽孢菌继续增加种群比较-茅台和汾酒1. 汾酒和茅台中均能分离到大量地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、 嗜热芽孢杆菌、乳酸菌2. 茅台中耐高温的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌， 以及其