毕业论文 - 柳枝稷DREB1a基因的克隆与功能分析

1、本科生毕业论文（设计）题 目: 柳枝稷DREB1a基因的克隆与功能分析 姓 名: 学 院: 专 业: 草业科学 班 级: 学 号: 指导教师: 职称 2015 年 5 月 27 日南京农业大学教务处制目录摘要1关键词1Abstract1Key words1引言（或绪论）11材料与方法Y1.1试验材料 Y1.1.1植物试验材料、Y1.1.2菌种和质粒YY1.1.3工具酶和试剂.Y1.1.4主要仪器Y1.2试验方法 Y1.2.1柳枝稷 DNA的提取Y1.2.2 DREB1A基因的克隆及序列测定Y1.2.3DREB1A基因生物信息学分析Y1.2.4荧光定量PCR分析柳枝稷DREB1A基因表达特性Y2

2、结果与分析Y2.1柳枝稷DREB1A基因的克隆及鉴定Y2.2 柳枝稷PvDREB1A基因序列分析Y2.2.1 PvDREB1A基因全长序列的结构特征Y2.2.2 PvDREB1A二级结构预测Y2.2.3 PvDREB1A的三级结构预测Y2.3 柳枝稷DREB1A基因表达模式分析Y2.3.1 干旱胁迫下PvDREB1a的表达特征Y2.3.2 低温胁迫下PvDREB1A的表达特征Y2.3.3 ABA处理下PvDREB1A的表达特征Y2.3.4不同光周期处理下PvDREB1A的表达特征Y3讨论 Y4结论 Y致谢Y参考文献Y 柳枝稷DREB1a基因的克隆与功能分析摘要: 本文利用PCR技术从柳枝稷中克

3、隆与植物耐旱相关序列DRE相结合的转录因子DREB1A的基因.并对该基因序列进行了分析：基因全长708bp，无内含子，编码235氨基酸残基和典型AP2功能域，等电点pI=5.17分子量PA=25.23KD。通过荧光定量 PCR 分析表明，该基因表达随植物自身节律发生变化，且受到干旱和低温诱导，但不受ABA诱导。关键词:柳枝稷；DREB转录因子；基因克隆；表达分析 Cloning and Expression Analysis of PvDREB1A gene of Switchgrass (Pavnicum virgatum)Abstract：In this study, a abiotic

4、stress related DREB gene was cloned from the genome of switchgrass and was named as PvDREB1A. The gene is intronless and has a length of 735 bp, encoding a protein of 235 amino acids with a typical AP2 domain，a molecular weight of 25.23 KD and a theoretical isoelectric point of 5.17, respectively. A

5、ccording to real-time PCR analysis, we found PvDREB1A was transcriptionally regulated by the plant innate circadian and was induced by salt, dehydration, and low temperature treatments but not ABA treatment. Key words ：Switchgrass; DREB transcription factor; gene cloning; gene expression 干旱、盐碱、高温、低温

6、等非生物胁迫是影响植物生长发育的主要因素，植物受到逆境胁迫时会产生形态以及生理上和基因表达等适应性调节反应从而降低或消除危害1。根据与DNA结合的方式可以把TF分为两类：普遍性转录因子（general transcription factor，GTF）和特异性转录因子（sequence specific transcription factor），普遍性转录因子能和启动子的核心序列TATA框结合，可以激活所有基因的转录，但是特异性转录因子和DNA序列上的其它调节元件结合，只能激活特定的基因2。自从1987年PazAres首次报道玉米转录因子基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控干旱、高盐

7、、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种。研究发现在拟南芥中编码转录因子的基因至少有1800个，约占其基因总数的5.93，而且这些转录因子在调节植物生长发育以及对外界环境的响应方面起着重要作用4。 DREB转录因子(Dehydration Responsive Element Binding protein)，即干旱应答元件结合蛋白质5,6与 DRE（dehydration responsive element）顺式作用元件相结合，调控对干旱、高盐、低温等逆境应答相关基因表达的蛋白质。近年来DREB类转录因子的发现是植物抗逆性研究方面最具突破性的进展之一。它在植物应答

8、干旱、高盐及低温胁迫信号的过程中起重要的调控作用。 DREB转录因子，其基因内均无内含子。从蛋白质结构分析，DREB转录因子具有典型的转录因子结构特征：在C-末端富含酸性氨基酸，功能是作为转录激活区；N-末端富含碱性氨基酸，是核定位信号区；中间由58个氨基酸残基组成的AP2/EREBP结构域，可形成3个-折叠和1个-螺旋结构，其中位于第2个-折叠中的第14位的缬氨酸(V)和第19位的谷氨酸(E)非常保守7，特别是第14位的缬氨酸(V)，对决定DREB转录因子与DRE顺式作用元件的特异性结合起关键作用。在DREB转基因植物中，DREB转录因子基因的过量表达可以激活靶基因的表达，提高植物对低温、干

9、旱等逆境的忍耐力。 植物在非生物环境胁迫条件下，通过对各种逆境因子的感受，将细胞外信号转化为胞内信号，再通过信号的各级传递使使 DREB 转录因子与 DRE 顺式作用元件相结合，转录调控目的基因的表达，使基因产物的积累，最终引起各种生理生化调节，最终使植物抗逆性获得增强8。由于植物对低温、干旱、高盐等逆境胁迫耐性受多个基因的控制，因此其抗逆性的强弱受多个因子的协同调控9。DREB 转录因子能够识别 DRE元件，与基因启动子区域的DRE顺式作用元件特异性结合，在信号传导过程中对诱导下游许多抗逆相关的功能基因表达中起到关键作用。因此，利用转录因子的作用来增强植物抗逆性，从而改良植物抗逆性成为植物育

10、种的重要途径。柳枝稷 (Panicum virgatum L.) 是一种重要的能源植物种，是禾本科黍属植物，植株高大，根系发达，叶型紧凑具有根茎。柳枝稷耐旱耐湿，能生长在各种天然沙地或肥沃土壤都能生长，适应性很强，适宜其生长的 pH 为 4.97.6，在中性条件下生长最好9。柳枝稷水肥资源利用效率高，寿命长可达到 10 到 15 年。它是典型的多年生暖季型草，有较好的草料特性和水保持水土的能力。由于柳枝稷的适应性强，能迅速生长，产量高，对土壤要求低，需水、需肥量少，病虫害少等优点，被认为是植物能源的潜在来源，越来越受到人们的关注。而且，它是 C4植物，其水分利用率高，通过多种代谢途径来进行碳的

11、固定。柳枝稷作为植物能源原料种植，不会污染环境，能减少空气污染和降低温室效应，通过固定地下碳来提高土壤质量，有利于水土保持和生态保护；燃烧是不会产生一些有毒气体；低成本，其转化气体或液体的过程较简单易操作；可再生，可以循环利用；利用安全及方便等10。 我国地域辽阔以及丰富的植物多样性为研发能源植物提供了优越的条件。当下我国还有很多没有开辟的荒地，在荒漠土壤中种植能源植物，有利于植物能源的研发及生态恢复和减少水土流失11。由于能源植物不能与粮争地，因此需要重复利用边际地和退化土地。然而针对边际地和退化土地的主要问题（干旱、盐渍化、重金属污染等），能源植物、特别是高大的多年生禾草（如柳枝稷）能够在

12、边际地生长，并对土壤有修复作用。同时能源植物如柳枝稷生产的绿色燃料，有利于生态保护，并对不可再生资源有一定的补充作用。 为了进一步提高柳枝稷对边际和退化土地的适应能力，提高其生物产量，有必要进一步增强其抗逆性。植物的抗逆性状是多基因控制的数量性状，它对干旱、高盐及低温耐性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。一个转录因子可以调控多个基因的表达，通过增强一些关键的调节因子的作用来促进这些抗逆基因发挥作用12，有望使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。植物基因工程以植物为对象，采用重组DNA技术，将外源目的基因导入受体植物基因组，最后获得外源目的基因正确表达和稳定遗传的新植物类型

13、。基因工程是在离体条件下，对不同生物的遗传物质进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。 本研究以筛选克隆植物抗逆重要途径的转录因子家族DREB为研究对象，对该家族基因进行生物信息学分析，并克隆DREB1a编码基因，在烟草中验证其生物学功能，为柳枝稷抗逆育种提供理论基础。1. 材料与方法11 材料1.1.1植物试验材料:柳枝稷Alamo，取成熟饱满的柳枝稷种子，于25、光强度2500Lux和12 h光周期条件下培养。待其长到30cm时，摘取叶片存于液氮以提取基因组D

14、NA，RNA。1.1.2 菌株和质粒:植物表达载体pEntryD均由南京农业大学实验室保存并提供，大肠杆菌DH5a1.1.3工具酶和试剂 （1）限制性内切酶，修饰酶及试剂盒：BamHI和HindIII内切酶，T4-DNA连接酶，Taq聚合酶，反转录酶AMV，DNA Maker,DNA提取试剂盒均购自生物公司，植物基因组DNA小量提取试剂盒DNA清洁试剂盒购自平原皓生物公司。（2）其他药品：琼脂糖，Tris，焦碳酸二乙酯（DEPC），蛋白胨，酵母提取物，氯仿，异戊醇，乙醇，异丙醇，Na Cl，CaCl2等1.1.4主要仪器 PCR扩增仪，高速冷冻离心机，纯水仪，电泳设备，凝胶成像系统。超净工作台

15、荧光定量工作机器1.2 方法1.2.1柳枝稷DNA提取： 植物gDNA提取试剂盒(离心柱型)购自原平皓生物公司。新鲜的植物组织研磨后迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗离心步骤, 进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。1.2.2 DREB1A基因的克隆及序列测定引物设计:根据已经公布的DREB1A基因序列，采用primer premier

16、5软件分析后,设计引物序列，如下:P1 5-ATGTGCCAAATCAAAGAAG-3；P2 5-GTAGCTCCAGAGTGGCACATCGATGAT- PCR反应体系与反应程序：PCR反应体系总体积为25l,其中:Q5Taq Premix 12.ul，浓度为5mmol/L的P15-ATGTGCCAAATCAAAGAAG-3，P25-GTAGCTCCAGAGTGGCACATCGATGAT-3引物混合物2.5l，柳枝稷DNA溶液2.5l(200ng)，去离子无菌水7.5l。反应程序为94变性4 min，接着进行30个循环(94，30s；55，30s；72，1min) 的扩增，最

17、后72保温2 min结束反应。 PCR产物回收及克隆：将PCR产物经琼脂糖凝胶纯化回收,BamHI和HindIII双酶切PCR产物，纯化、回收后用DNA Ligase I链接入pEntryD载体， 取连接产物5l和大肠杆菌DH5制备的感受态细胞200l混合，冰浴30 min，42热激90 s，冰浴2 min，加入1ml的LB培养基，37预培养1 h后涂布于LB液体培养基的平板上，37倒置培养16 h左右,观察平板上菌落生长情况. 重组克隆的筛选与鉴定： 阳性克隆的筛选：在添加Kan的LB琼脂平板上加入40LX-ga（l5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷，20 g/L）

18、、40LIPTG（异丙基-D硫代半乳糖苷，200 g/L）13，用无菌玻璃涂布器将两种溶液的混合物均匀涂布于整个平板表面，室温放置至液体安全吸收；取待接种150L转化后的细菌均匀涂布于培养基表面，待接种物完全被吸收后，将平板倒置于37培养箱中培养1216h后，将其移入4放置一段时间，以使蓝色充分显现；观察蓝色与白色菌落生长情况14。 重组质粒的PCR鉴定15：从筛选平板上挑选出白色单菌落并划线扩大培养,并对白色菌落逐个进行PCR再鉴定。PCR反应体系:Q5TM高保真酶聚合酶，12.5l，引物2.5l，用牙签挑取白色菌落少许置入反应管中，去离子无菌水10l.PCR反应程序:9830 s，9810

19、 s，7030 s，共30个循环，最后72保温5 min，结束反应16。反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。 序列测定：将PCR反应呈阳性的克隆寄送到上海生物工程公司进行双向序列测定。1.2.3PvDREB1a基因的生物信息学分析 利用柳枝稷基因库（http:/www.kazusa.or.jp/jatropha/）搜索PvDREB1A基因的全长；NCBL中的ORF(/gorf.html)预测开放阅读框；BLAST(/blast.cgi)进行同源性分析；ExPASy的compute pI/M

20、w(http:/www.web.expasy.og/compute_pi)计算蛋白质的等电点、分子量；SOPMA预测二级结构；SWISSMODEL预测三级结构；DANMAN进行序列对比；MEGA建立PvDREB1A蛋白及相关蛋白发生树17,18。 1.2.4荧光定量PCR分析柳枝稷DREB1A基因表达特性 分别提取将生长株高为30cm的柳枝稷置于以下三种条件200mM的氯化钠，20（重量/体积）PEG6000低温（4）和100um的ABA下处理，并各自设置0.5h，1h，2h，4h，8h，12h和24h小时对照。将这些植物在30（除了低温处理）的1/2Hogland营养液中培养。处理完成后，每

21、种处理至少选取三个植株的从顶端计数的第三叶片，剪取，合并，并立即在液氮中冷冻并贮存于-70条件下，分别提取RNA，并进行DNase处理,除去DNA污染。利用Promega公司的MMLV反转录酶反转录生成cDNA 。 根据基因设计定量引物，qRTPvDREB1A_1-5TGTGCCAAATCAAGAAGGAG-3,qRTPvDREB1A_2-5GAGGTCGAGGTCGAGGAC-3。采用qRT-PCR（荧光定量PCR）19对不同胁迫处理下DREB1A的表达模式进行分析，以未处理（0 h）为对照，以AmeIF1为内参基因。反应体系（10L）：2×SYBR Green Supermix5

22、L，上下游引物（10mol/L）各 0.3L，稀释后cDNA 模板0.8L，ddH2O 3.6L。 反应于荧光定量 PCR 仪上进行。反应条件：95预变性5 min；9510 s，6020 s， 循 环40次 ；55 10s（0.5/ 循环）16，循环 81 次。采用基因表达相对定量分析，将对照样本的基因表达量设为 1，处理样本中的基因表达量变化的倍数用 2- Ct来表示，其中： Ct= Ct（处理）- Ct（对照）， Ct=Ct（目标基因）-Ct（内参基因），计算在不同处理下基因的表达量，其中每个处理重复 3 次，每个重复做 3 个平行20。 2 结果与分析2.1柳枝稷基因DREB1a基因的

23、克隆及鉴定 提取柳枝稷gDNA，以其基因组DNA为模板，用特异性引物P1 5-ATGTGCCAAATCAAAGAAG-3；P2 5-GTAGCTCCAGAGTGGCACATCGATGAT-3进行PCR扩增，柳枝稷DREB基因内部没有内含子。将得到的目的片段（约912bp）（见图一）从琼脂糖凝胶上切下回收，与克隆载体pEntryD连接，转入大肠杆菌DH5a中，通过蓝白斑筛选鉴定。图一：凝胶电泳图2.2 柳枝稷DREB1a基因序列分析 将连接有目的片段的克隆载体 pUDR 测序后，经序列测定可知目的基因的大小为912bp，即PVDREB1a。它与 Gen Bank 上公布的粟米SiDREB1 基因

24、（登陆号：SI031001）序列相比，同源性为 77.4%，与水稻的OsDREB1基因的同源性为70.2%，与玉米ZmDREB1的同源性为69.4%，高粱SobDREB1的同源性为69.8%。不同品种间基因进行多序列比对并构建系统进化树(图4).发现该基因与其他几个基因的氨基酸水平同源性都比较高;其中与粟米SiDREB1的相似性最高,与玉米DREB1的相似性最低,为69.4%。（见图二）图二：不同种间DREB1A亲缘关系在Phytozome中搜索与 PvDREB1a-1 氨基酸序列相近的11个编码DREB 氨基酸序列 ：PvDREB1A系列、PvDREB1B系列、PvDREB1C、PvDREB

25、1G系列。通过构建的系统进化树发现，PvDREB1A系列与PvDREB1B系列的情缘关系较近，与PvDREB1G系列情缘关系次之，与PvDREB1C系列亲缘关系较远。（见图二）图三：同种植物间DREB1A基因系列亲缘关系对比2.2 PvDREB1a基因的生物信息学分析2.2.1 PvDREB1a基因全长序列的结构特征 采用DNAMAN 7.0 分析从柳枝稷转录本数据库中获得的 1 个编码 DREB 的基因全长序列。序列全长为912 bp，其中 5' UTR 长度为72 bp，3' UTR 长度为 165 bp 。ORF 编码区长度为 675bp，可编码 235个氨基酸（图三）。

26、计算其等电点（pI）为 5.17，分子量（MW）为 25228.9 Da。PvDREB1a 不存在跨膜结构，不是跨膜蛋白。用SignalP 3.0Server 在线软件分析确PvDREB1a不具有信号肽。用 PSORT 对PvDREB1a 的氨基酸序列进行亚细胞定位分析，推测其定位于细胞核中。采用cNLS Mapper 对 PvDREB1a的氨基酸序列进行核定位信号分析，确定其核定位信号序列由20个氨基酸构成（见图四）。CACAATTCAAGCAGGACCAAAGGCAGCAACAGCACCCCGGGCTCAAGCGAGCTTGAAGTGATCAGAACAAGG 7172 atgtgccaaa

27、tcaagaaggagatgagcgccgagtcgggctccccg M C Q I K K E M S A E S G S P 117 tgcagctcggccacgtcctcgacctcgacctcgtcggagcaccac C S S A T S S T S T S S E H H 162 cagacggtgtggccgtcgccgccgaagcggcccgcggggcggacc Q T V W P S P P K R P A G R T 207 aagttccgggagacgcggcaccccgtgttccgcggcgtgcggcgc K F R E T R H P V F R G

28、V R R 252 cggggcaacgccgggcggtgggtgtgcgaggtgcgcgtgccgggc R G N A G R W V C E V R V P G 297 cgccgcggctgcaggctctggctcggcaccttcgacaccgccgag R R G C R L W L G T F D T A E 342 ggggccgcgcgcgcgcacgacgccgccatgctcgccatcgccggc G A A R A H D A A M L A I A G 387 gcgggcgcctgcctcaacttcgccgactcggcgtggctcctcgcg A G

29、A C L N F A D S A W L L A 432 gtccccgcctcctacgccagcctcgccgaggtgcgccacgcggtc V P A S Y A S L A E V R H A V 477 gccgaggccgtggaggagttccagcgccgggaggcgctcccggag A E A V E E F Q R R E A L P E 522 caggaggacgcgcgctcggccacgtcctcgacgccgtcgtaccct Q E D A R S A T S S T P S Y P 567 gccagcgacgacggcagcgccaccgacggc

30、gaggggtcctctgac A S D D G S A T D G E G S S D 612 tcctccccggccaccggggcctcgccgttcgagctggacgcgttc S S P A T G A S P F E L D A F 657 aacgacatgagctgggacttgtactacgcgagcatggcgcaggcg N D M S W D L Y Y A S M A Q A 702 atgctcatggagccgccgtctgcggtcatggagttcggcgacgcc M L M E P P S A V M E F G D A 747 agcatcatcg

31、atgtgccactctggagctactag 779 S I I D V P L W S Y *780 AAGCGATGCTGCTGAGCCGGAGCTTAGCTTTTCCTTTTTCTTTCACATGGCCTCGGACGCCATTTCTTTTGCCTGTATGTAATTTTACTTCTTTGAGAAAACAGAGCAAAACAGAGCATGCCCATTTGACTTT 912图三柳枝稷PvDREB1A所编码的氨基酸序列特征第1-71位的71个核苷酸为5非翻译区（5-UTR）；第780-912位的133个核苷酸为3非翻译区（3-UTR）；第72-779位的708个核苷酸为开放阅读框；*为终止密

32、码。图四 PvDREB1a基因的和定位，图中浅绿色部分2.2.2 PvDREB1a二级结构预测 基因功能的最终表现在于它所编码的蛋白质的功能，而功能的实现取决于其高级结构特征。二级结构预测表明PvDREB1a的二级结构主要有 3 种类型，分别为 -螺旋、-折叠片和无规则卷曲。3 种结构所占比例不同，以无规则卷曲较少占5.11%，-折叠片为主79.57%，-螺旋占15.32%（图五）。图五：PvDREB1a二级结构饼状图2.2.3 PvDREB1a三级结构预测2.3 PVDREB1a基因的表达模式分析2.3.1 干旱胁迫下PvDREB1a的表达特征 以 20% PEG6000 模拟干旱胁迫处理，

33、采用 qRT-PCR 研究PvDREB1a在干旱胁迫下不同组织中的响应特点，结果下表显示，PvDREB1a表达量在叶片中不同时间点的逆境表达模式不同。PvDREB1a表达量在干旱胁迫不同处理时间条件下表达两差异显著，1 h 表达量达到最大值，为对照水平的12.73 倍；随着胁迫时间延长，表达量呈明显急剧下降趋向于0。2.3.2 低温胁迫下PvDREB1A的表达特征 在40C低温条件下，采用qRT-PCR研究PvDREB1A在低温胁迫下的响应特点，结果（图）显示，PvDREB1A在不同低温处理时间的逆境表达量差异显著，与对照相比皆表现为上调表达，且随胁迫时间延长表达量有先上升后下降趋势，在 4

34、h 表达量达到最大，在低温处理8h时PvDREB1A表达量最小，只占据表达量最大时的1/7，低温处理0.5h、2h、12h时候，基因的表达量相似。2.3.3 ABA处理下PvDREB1A的表达特征 ABA处理条件下PvDREB1A基因表达量呈现先增加后下降的趋势，在处理8h时刻，表达量达到最大，表达量最小的时刻在处理时间4h时，以处理时间4h为界限，0h-4h和8h-24h两个处理时间段内，表达量均呈现下降显著趋势。与对照相比，ABA处理诱导PvDREB1A基因表达量差异不大。2.3.4 不同光周期处理下PvDREB1A的表达特征 在一个光周期内，早上五点开始一直到下午五点都进行光照处理，下午

35、五点一直到第二天早上五点处于黑暗处理条件下。从下图可以看出，5:00pm光照处理开始时，DREB1A基因的表达量呈现先增加后下降然后趋于平缓的趋势。在光照条件下，基因的表达量都处于较高的水平，并且差异较大。黑暗条件下，基因的表达量处于较低的水平，个时间段含量处于相对平缓趋势。 3. 讨论 植物对干旱、高盐及低温等逆境条件的反应往往不取决于某一单个因子，其性状受许多因子影响。而一些在信号转导过程中起调节作用的蛋白质因子,尤其是一些转录因子、蛋白激酶等，单基因的高效表达就可以激活很多靶基因的转录和表达,达到多个功能基因的效果，因此，克隆和鉴定这些基因的功能，对于研究分子生物学及基因工程都有重要的价

36、值。 DREB转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量具有促进作用，说明DREB因子在植物抗逆反应中起着重要作用。这也给人们一个启示:对于植物抗逆基因工程，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，在提高作物对环境胁迫抗性的分子育种中，改良或增加一个关键转录因子的调控能力可以提高植株多方面的抗逆性，如抗旱、抗冻及抗盐等抗逆性。 本研究通过基因克隆方法，成功柳枝稷克隆到DREB1a基因，命名为PvDREB1a。通过基因序列分析表明该基因具有典型的DREB基因的AP2保守结构域，是植物DREB基因家族的一员。实时荧光定量PCR分析表明，在逆境条件下如低温、干旱、盐胁迫，以

37、及光周期处理条件下，该基因能够上调表达，说明该基因在植物的抗逆反应中起重要作用，同时ABA处理也证明了该基因的表达不受ABA的诱导。为了研究该基因在植物抗逆反应中的作用，还需进行后续工作：利用农杆菌介导法，在烟草中超量表达该基因，筛选到单拷贝插入的转基因烟草，生物学检测验证pvDREB1a基因的超量表达能明显提高转基因烟草的抗干旱及高盐的能力，表明pvDREB1a基因在植物体内的分子功能是提高植物的抗渗透胁迫能力。本试验中DREB1A基因片段的成功分离对本实验室获得抗逆性强转基因柳枝稷具有重要的意义，为柳枝稷的育种奠定坚实基础。4.结论 从柳枝稷中克隆出的 DREB1a-1 基因具有DREB1

38、类转录因子的典型特征。同源性分析表明：它与柳枝稷PvDREB1a-2 氨基酸序列的同源性较高，采用荧光定量RT-PCR技术研究了柳枝稷DREB1a基因在不同处理条件下表达情况，结果表明：在不同时间，不同胁迫处理下，柳枝稷DREB1a基因的表达水平具有一定的差异。在干旱和胁迫下，DREB基因的表达量在1h时达到最高，而在冷胁迫下，它的表达量在4h时达到最高。在低温处理诱导下柳枝稷DREB1a的表达情况与干旱和冷胁迫相似，都是先增加然后降低的趋势。PvDREB1a基因在转录水平的表达受干旱和高盐低温逆境环境的诱导，这也表明PvDREB1a参与了植物抗逆过程。参考文献：1山仑、黄占斌、张岁歧。节水农

39、业M北京：清华大学出版社.2000，1213. 2姜文来，中国 21 世纪水资源安全对策研究M.水科学进展，2000，5：2326. 3Gallo Meagher M and Irving JE. 1996a. Herbicide resistant transgenic sugarcane plants containing the bar gene. Crop science，36(5)：1367-1374. 4Arencibia A， Vazquez RI， Prieto D. 1997. Transgenic sugarcane plants resistant to stem borer attack. Molecular Breeding， 3(4):247-255. 5Oh SJ，Song SI，Kim YS.Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in Transgenic Rice Increased Tolerance to Abiotic Stress without Stunting Growth.Plant Physiology，2005，