southern印迹法

1、实验七 Southern印迹法1 .熟悉Southern印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。2 .了解Southern印迹的意义。 原理Southern印迹法（Southern Blot）是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DN研段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DN/性（使双链DNA变成单链），通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；？经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA分子与32P或35S标记的D

2、N僦针按互补原理进行杂交； 经放射自显影对特定位置上显现的特 异DNA片段进行分析。这种方法最初是由 Southern于1975年建立的。方法中DNA转移的方 式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异 DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段（常用Hind m 或EcoRI 降解的入DNA内标准，精确测量各标准片段 与电泳原点之间的距离。以DNA勺Logkb为纵坐标，移动距离（cm）为横坐标，连接各已知条带相应的

3、点，得到一条标准曲线。 然后测量未知条带（放射自显影后获得的特异片段 ）的移 动动距离，在标准曲线上找出相应的Logkb值，以此计算出其分子量大小。器材与试齐【J 一、器材1. 电热真空干燥箱2 .硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3. 大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4. 滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（ Parafilm ）、一次性手套等5. 刀片、刻度吸管、镶子、剪刀、 lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1. 酸变性液：0.25mol/L HCl ，用分析纯的盐酸（12Mol/L ）稀释2. 碱变性液：0.5mol/L NaOH , 1.5mol/l NaCl （pH13.1）3. 中和液：

4、0.5mol/L Tris - HCl（pH7.5）,1.5mol/L NaCl4. 20X SSC: 0.3mol/ L柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0（ 配方见附录）5. 10X SSC和2X SSC用双蒸储水稀释 20X SSC储存液实验步骤注意：操作戴手套！1 .凝胶处理：1）凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角（？点第一个样品的一侧）切去作为标记，以便于定位。精确测量凝胶大小，然后将凝胶放入一个方形瓷盘中；2）变性：将凝胶浸泡于适量的碱变性液中，室温下变性30分钟，期间更换变性液一次，不断地轻轻摇动（如果先进行酸变性酸变性，则凝胶中漠酚兰的颜色由黄变兰）。

5、对于较大的DNA片段（？如大于15kb）,凝胶可在碱变性前用 0.25mol/L HCl预处理10分钟使DNA片 段脱喋吟（凝胶中漠酚兰的颜色由兰变黄）后再进行碱变性；3）中和：移去瓷盘中的碱变性溶液，用双蒸储水漂洗凝胶两次，然后浸泡于适量的中和液中，室温下轻轻摇动 15分钟，更换新鲜中和液，再中和 15分钟；2. 膜处理1）剪下一张与凝胶面积相同的硝酸纤维素膜 （NCP）或尼龙膜（NL）。注意NCPk要剪去一角且不可用手触摸，粘有油腻的膜不能被湿润，也不能结合DNA同时剪810张与NCP亭大的干净滤纸；2）将NC咛34张滤纸依次漂浮于盛有双蒸储水的带盖方盘中，使水自然从NCP的下面向上浸润，

6、待其完全浸湿后，连同浸湿的滤纸一起浸入于转移液中浸泡510分钟。？注意：在蒸储水中如 NCP面有气泡时，可将其放在65水浴中浸泡几分中，仍有气泡或不能完全被湿润（膜上有白色或黄色斑块）则不能用于转移。3. 转移1）取一个较大的方形瓷盘，放一块玻璃板于盘上，盘内加转移液（6 x SSC或10X SSC）使液面距离玻璃底面约 12cm,玻璃板表面盖两张预先用转移液浸润的Whatman 3M瓢纸（也可用新华滤纸），滤纸两端浸入 SSC专移液中，用一玻璃棒将滤纸压平，滤纸与玻璃板间不得有气泡；2）将琼脂糖凝胶翻转（样品孔朝下）后置于上述铺有 Whatman 3M就纸的平台上，注意： 两者之间不能有气泡

7、。3）用parafilm 蜡膜将凝胶四周平台上裸露的滤纸封严，防止在转移过程中因短路（转移液直接从盘中流向吸水纸而不经过凝胶）使转移效率降低，甚至转移失败；4）将处理好的NCP©切去一角）小心地覆盖在凝胶上（滤膜的光泽面即标有 N.C字样的 一面朝向凝胶），NCP勺一端与凝胶的上样孔对齐，切去的一角与凝胶切角的位置对齐。注意：滤膜与凝胶之间不能有气泡，且NC旦与凝胶接触即不可再移动，因为从接触的一刻起，DNA已开始转移；5）将预先用转移液浸润过的与 NC吠小相同的 Whatman3M滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，排出滤纸与膜之间的气泡;6）再放几张相同大小的干滤纸和一叠厚约1015cm的

8、吸水纸于滤纸上，顶部压一块玻璃板和1kg左右的重物。7）静置1215小时使其充分转移， 其间换吸水纸12次。转移液在吸水纸的虹吸作用下从盘中转移到吸水纸上，从而带动DNE琼脂糖凝胶中转移到 NCP上；8）转移结束，移去吸水纸和滤纸，在NCP上用铅笔标上点样孔的位置。？将NC眼泡在2X SSC中5分钟以去除琼脂糖碎块。将膜放置于一张干燥的新鲜滤纸上；9）在紫外灯下观察凝胶和 NC破，以了解DNA专移的情况。？在紫外灯下凝胶不显示荧光，NCP膜呈桔红色，并可见到条状的DNAt。10）把NCP®于两层干燥新鲜的滤纸间，真空下80C烘烤2小时（亦可用其它方法）。此过程可使DNAM加牢固地固定

9、于 NCP上。11）此NCP既可直接用于杂交，亦可用塑料薄膜密封，置一20C冰箱保存备用。注意事项1. 操作时戴手套，严禁用手接触凝胶和硝酸纤维素膜；2. 转移时，滤纸与膜、膜与凝胶、凝胶与滤纸桥之间均不能有气泡，否则影响DNA转 移；3. 凝胶易碎，操作时应格外小心；4 .硝酸纤维素膜上的 DNA®定非常重要，固定不好时DNA?E杂交过程中会脱落下来；烤膜温度过高，膜脆性增加，易碎；5. 大片段DNA专移效率低，可在碱变性前用0.25mol/L HCl浸泡凝胶1015分钟，使 DN"子脱喋吟或用短波（260mm）紫外光照射1020分钟后再行碱变性、转移以提高大片段 DNA勺转移效率。6. 转移液中盐离子浓度对转移有较大影响。10 x SSC条件适中，能有效地转移120kb的DN喝段，速度也比20X SSC快，比较常用：6 X SSC专移速度最快，？对于高分子量 DNA 片段（10kb）的转移较理想，但小分子DNA易丢失。若转移 DNA片段较小，则宜选用2