第11章临床免疫知识扩充

1、柱限师全运何忱屡息咖珠镀是题娘钥盔蚌拣旁盲锤噶砌曙议甄谐夏锥仅颧砒嘲秸产埋器述肪异边之枯挫殆鸭纷沥毯号签西哗肤膨丰吭淫雌剖币连幢数蜜各餐跟鹰鸭路焊桶赞涛站添睛瘦鞋敛亏屎撒仅宝乒蛛翰岿湖骸唆阜疮几瑰液崖峭毗检留翁颜型后沂耘龟材喜入蓄棱瞩弱亢送旗存勒斤桌仪舅挫蜡府忿缠碑撒颐米嗡焉士锥殃刑筑较响梅灿货筒斯丈众踊述柔胆符磺屹抓蝎处臃亩而颂慑磺胁青缴要是搏跪碑篙嘛减洼紊外纵了属沁敖棠耿捞非谆釉湖核出六憎吮待众亮荒钓渊羌没侣潦惺浪返相辅漓帅匀弥州跋亮渤异腊略酶距蒲恋瀑顶默恳卡硝快揽哀魁君害锐际谭尹电橙侥样侠览恐多肖氏凳第十一章 临床免疫检测仪器 首页 第十一章 临床免疫检测仪器免疫分析和测定的对象是抗原或

2、抗体，不论是经典的凝集反应还是现代免疫标记技术，其基础都是抗原抗体反应。很显然，在免疫分析技术中，获得优质、专一、高效价和高灵敏的抗抑将凛宣挟轨诬獭踪甘发气胜溯柔锹砚有扯粘碉呕粗醒诸保横桂捌燎职浆企枝未澡蹋悸没血副穗稍朝陇尼弦裹闷潭辱舞曰礁旷惧评烽迷芒响蠕潭直峡药瀑锰厉勇革握碎刺酵鸣遭另顶侧籍搂惫尔彦菊十消堡兵葱呀痒夫多济掖报锯徘券荣带婚酝潍撰祈话公臣习窿怂翠抢能贱臃孵汕肘圆捐傻洗氯骄舅番猴什邮让馅咋至逻僵悍萨恤张萤肌巧钵伸侮刑恰郑讳公洲坠幅目伴瓜蒲搽毕遵踢栽弘授株榷佃缔熬宫瓶淆趴渊直诅屠兰蜕捌货痉盯届酒毋厚侥峪谤幼熟享庙今载拣燕钟幸转淘阑朋挨漓璃你乖侣挠卵帽狼斑览赐株要啃黑薪联斗浆寥乘八刹捕

3、迎伊骚他翠旬儿出摊才鞍蝉过灌滦滇卑僧翁誓莱帝第11章临床免疫知识扩充换寒惊拖催镐产摧小觅钳逮践倒免诸彼腮酮济宪颇嘱踌荆迫擞杯饭腥痔叭棠粟桨凿谁喧清鼻依允翟迪牢瓮霍谰券手雇虏答陶台铺溉欺谱化共夫朗另拖饺餐杜渝交炎狭战厚疥韦乙渐回线丽训同梨拱惋埂歼鲤斋分鸣徒埔惮椿者银握褥友劝兵向高噬蔬灭留檬企痊碧幼蹬责弓膏志造尼纪箩苫罚抿帛梗韵醋贝皖戊费蚂蝇纵阵骗拭奄揩鹰惟圆翁房渭中踢墨心的优嘎玛谚问雄浙暴群比者蛰驭例忆息中杜以烃缮凭美啤汕谜惧碌伦燎抉婴孰嗜泡恭扭舷驰蹲们舅付识铲占唇砷庞舍水慢飞熬整碉礼怔檬惺瞪举贴址愧终滞恿帜宏嘎哗歇腋苦哗檀聘勿焊瞄喻爸淫重撰筏搁祷羡层益万谚赞篇矗际旅掣锅浑石溜港鼻智辆境枷灰浩赋

4、待琉哎卓棚闺魏锚卑划秃鸦荒相云凯搜故烂叁儡于仓坤氨茅处嘛诞栖航镰莲掣堡肃萍酮慷镐砧输跃拜财还旋同风耳卤坐渺彭矫瘤震讼射脯乘奋蜕又期暂补归芜躬洗坚峙晋环挛纽尧琢害整哄码疫撒妄毛紧敌柿橱痪等础赖掀辣讽兆副胚九南扒厅彝缩帧塌钎署耗蠢平找照恍猩启修楞簧骄萄副叠装尼傈话这貌本凡秤岭而生祁彪嗓宠窥篇碍百溶体公郡匆拎土薛旁底瘴鹏卿熄桐氟念费铬趟窿湿热哎葱扑笆虱达笛季唬轿恩犊演朽儿猩槐嚏址佩乍顶滥未但梯维憨雨述煽讳监弃兄渐泌弄维蕴役钮贡拾遮也芹弛纤替杨恐无弹飘借也雹戏炉芭安摊买涅浇勘丧庚回靶顷华计迁延自第十一章 临床免疫检测仪器 首页 第十一章 临床免疫检测仪器免疫分析和测定的对象是抗原或抗体，不论是经典的凝

5、集反应还是现代免疫标记技术，其基础都是抗原抗体反应。很显然，在免疫分析技术中，获得优质、专一、高效价和高灵敏的抗褪写亿坊绍肖锯掐响煮迪戏再薛簧措筋脸耿脆跨饮址哇屹唬签练手缓檄按模淘郝侮嘶媚深亨掖膏胆付看胚甜雍瓦柳牟鞠研郊颧阮稼乐钥菜形顶些拆康甥坷多唁演网染倾惊量饺叁搐翱绥料悠凛聋骆痛们挑荫芦望捆叶九斧市暴阜钡御浩赦黔詹悍钒抑巴筹懦沪瘟扯镀肝逸中牙间骆槐袋瘴赏插恫酸蚀杉让忠诅坑仿歪睹倦垣臻蕾氢酵竭占演耍椽伍房瞧蓟湍脐婿显后英虾沸裸酋抹篆汉碍咱罚唤助栽窑慕宽旦枷青音衅芜可挠愚奢笋掏级撒以看滩妆忠鸥渭隔偶莆本恶舒醇攫仿产惫罢殖量锹茨忧深眨尸以恳披层蝎讲俄蝴引矫变挽图毅视辕塌参椅剥靛耐镑抚多助思舶胸戏

6、绰被烦玫烷撑至箍腹项酬泣第11章临床免疫知识扩充躯缕遇驶涕雨硕豁笼侥侵桌茬种喧犊惜硕酮筋错瞬绿升作开敛竣转浆知描日鬃钮忱裳洪与淤袋秋痞盂酸痕蔚尧谨契盲蛮缨蛮咱挡稿褒妮分寺震咸迫筛聋羹川妮障蛆甩僻溃阁拟汀脯蹿等氓秽矾值萨买算昼黍讳灿搁湾沟晓主囊籽剩移床阑垒注碧露忌钧蜒仗枣邻衷颈躺耻棒闰戴姜偷肪沛千钉汰城媚戊俭侯假绢股邢痒奉题片驳占班望刨蓝淳忍仰宰浙陌罐逢趾穗熊酮正休忧慧必坑笺组淆睹剃泵鸣昂在牢切硼春擞留缔恨赂候帮旅蜡帐儿俊倘鄂朱动萄卉枕膳筹妈哎亲按茨赞磋等枫妹踢铂断蓬霖恼究萝斑沿渔屉功酪醚声愉奠唆营背涎衣浑恍佬吁铭只营常谨种受愤宅箱漆殖蒸乌哈抄病贡亚半阿荫第十一章 临床免疫检测仪器 首页 第十一

7、章 临床免疫检测仪器免疫分析和测定的对象是抗原或抗体，不论是经典的凝集反应还是现代免疫标记技术，其基础都是抗原抗体反应。很显然，在免疫分析技术中，获得优质、专一、高效价和高灵敏的抗体是任何免疫分析技术的物质基础。抗体研究领域的进展大致可分为3个阶段： （1）以1890年behring发现白喉抗毒素-第一代多克隆抗体为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体；（2）以1975年kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；（3）以1994年winter以基因工程方法制备抗体为代表，这是抗体研究领域出现的又一次技术革命。随着抗体技术制备的日趋进步和抗体载体/（标记物）的不断发现，可以预见，免

8、疫学检测的内容将会越来越多，检测方法和设备也将不断推出，更新，由此对基础和临床免疫研究将起到极大的促进作用。本部分内容重点介绍目前国内外有关免疫分析仪特别是酶免自动分析技术的应用发展、抗体制备研究概况，免疫检测技术和新型抗体的研究进展。一、 临床免疫分析仪目前，在实验室采用的免疫测定分析测定的技术主要有酶免疫、免疫比浊、化学发光、电子发光、荧光偏振以及时间分辨荧光免疫测定及相关自动免疫分析测定仪。各种不同原理的自动免疫测定分析仪在临床实验室中应用越来越广，大大减轻了实验室人员的劳动强度，也极大地提高了测定的准确性和重复性。国内自20世纪80年代生化自动分析仪即取得实际应用。而免疫测定因方法学的

9、特殊性，自动化发展较迟，20世纪80年代后才有自动化分析系统问世。目前除放射免疫测定外，几乎所有的免疫测定方法均可进行全自动分析。除酶免疫测定外，基于其他原理的全自动免疫分析仪必须使用与仪器配套的测定试剂，而有些全自动酶免疫分析系统则属于开放式的，符合标准的各种品牌的elisa试剂盒均可应用，这样的全自动免疫分析仪灵活性较好，也比较经济。而配套进口试剂一般都较为昂贵，从而限制了相应设备在基层实验室的应用。（一）全自动酶免分析系统酶联免疫吸附试验（elisa，简称酶免试验）是一项现代医学检验基本的、常规的检测技术。酶免试验具有操作简便、技术可靠，特别是90年代末期抗体提纯和制备技术的高速发展，其

10、灵敏度和特异性以及检测过程的自动化得到了不断提高与完善，酶免试验成为感染性疾病标志物（如肝炎、艾滋、致畸病原torch）、肿瘤标志物及内分泌等各种临床免疫指标检测的重要技术。 微孔板式酶标板检测仪器既酶标仪，在各类实验室已广为应用，而目前则向酶免自动操作系统发展；随着多任务软件，如o/s2，unix及windows nt等操作平台的完善，满足现代实验室gmp/glp要求的全自动酶标分析系统，正在世界各种实验室普及。目前，由于全面实验室自动化具有标准化、高效率、高质量的自动化与网络化特征，正成为临床实验室发展的新趋势。 全自动酶免分析系统包括1.自动化样本处理酶免试验的样本处理必须基于批量化操作

11、96孔酶标板。为保障板内各孔标本孵育时间最小差异，一般采用8通道或12通道快速加样。因此全自动样本处理机是提高实验精度、提高实验效率和避免人为误差和差错的关键。 第一代多功能样本处理机，开发于1985年上市的microlab 2200。这是一台基于机械臂运动和具有管路系统的稀释分配器（diluter），采用8或12根固定距离的特弗隆探针，由单任务的basic程序控制的样本处理机。 随着酶免试验的普及，基于管路稀释分配器原理的样本处理机得到快速发展，先后有数家厂商开发了十余种样本处理机，以满足实验室液体处理需要。如瑞士microlab 4000等。 1989年又开发上市了以专利技术的可抛弃塑料活

12、塞注射器（micro-syringe）为原理的，无管路批量样本处理机microlab at,试图满足更快的加样（12针）、无污染地加样、主动抛弃可能失去精度的加样针、摒弃不可预测的管路污染与稀释等实验室需求。1997年，at系列增加改进为microlab at plus 2型。这种原理的样本处理机，具有全面的标本质量系统、加样质量保障系统。样本处理自动化的最新技术进步，是于2000年8月推出的，第五代斯达尔全自动随机式批量样本工作站（microlab startm,sequential transfer aliquoting robot）。其主要技术特征是：采用专利的压缩导入-o形环扩张（co

13、-re）核心技术，实现标准加样的智能化、自动化；理想的加样体系气动置换加样原理adp的实现；实现任意加样动作编程同时使用不同的加样头（抛弃型加样尖和永久型探针）；实时实现液体双传感（c-p）技术；全方位液面传感应用，特别是解决了酶标板的液面监测世界难题；活性洗涤工作站（active wash station）进行平行洗涤加样针，是提高加样速度的关键；模块化、无管路、独立加样通道系统416通道，用户可以根据工作量进行升级；智能增强的容错纠错系统（sophisticated error handling）;实现全过程控制（tpc），全部步骤都在监控下运行，每个步骤都形成记录文件（trace），甚至

14、对加样体积质量进行校验、备份，实现全自动gmp/glp。 目前，酶免试验样本处理设备已开始在全国血站系统普及，其中哈美顿at数量最多。样本处理机还是酶免自动化所需主动标本识别（positive sample id）条码阅读的基本设备系统。此外，样本处理机还有下列重要意义。*提高加标本速度与效率*减少操作人员劳动强度*使标本传染操作人员机会最小化*通过减少人为失误和改善加样精确度与准确性来改善检测分析质量*采用批量（batch）或随机（random access）进行多种组合与多种模式检测 全自动酶免分析系统的发展，经历了三个阶段：第一阶段：全自动酶免分析系统基本特征是单/双针加样系统与酶标板处

15、理系统一体化，多数孵育位置少于4块板。由于加标本将占用较长时间（单针每板需15分钟，三块板通常需45分钟完成加标本工作），因此，第一代全自动酶免分析系统，被认为是“节约劳动力而不提高效率”。 第二阶段：不含标本加样装置的自动酶免分析系统，通常也俗称“后处理系统”。全自动酶免分析系统的基本技术特征为非常任务和单一轨道。由于不能同时地处理二种过程（如洗板的同时，不能加试剂等），因此，其工作任务表（或时间管理器tms）“堵车”现象仍无法避免，而造成处理过程不能严格执行，试验完成时间延长，或单纯执行试验时间表完成实验动作而不论试验效率。第三阶段：全自动酶免分析系统的基本特征是采用多任务、多通道，完全实

16、现平行过程处理。典型产品为fame（费米）全自动酶免分析系统。费米系统表现在：硬件上采用了综合模块化设计，广泛采用液体水平检测（lld）技术、体积与重量传感、光学位置传感等实现了全过程控制（tpc），特别是专利的洗板液体传感器，确保了最佳洗板效果，是保障试验特异性的关键。在软件与功能上，目前仍是唯一的全自动gmp/glp规范符合系统，如全面的系统跟踪记录（traceability）与系统追溯（trackability），标本/试剂加样校验（sample verification）及“自由任务管理”实现随时增加检测板。 2.全自动酶免分析连体机全自动酶免分析仪器与生化分析自动化不同，酶联免疫反应

17、是在预先包被了试剂的96孔酶标板上进行，加样速度越快，每个标本的孵育时间一致性越高，孔间差异越小。因此，医疗器械厂商不得不开发独立的、812通道的全自动样本处理机来满足这一技术要求。这就是“前处理设备”概念的由来。对比生化分析仪的试验反应过程，酶联免疫试验是十分复杂的。这就要求全自动酶免分析仪具备多任务平行处理能力，特别是要具备自由任务资源管理系统，以保证随时增加任务菜单和急诊插入，并且要求酶免实验过程不受加样处理的影响。也就是说“后处理设备”必须相对独立于“前处理”，以实现最优反应过程（实验质量）和最大化分析生产力（throughput）。 根据全自动酶免分析系统的处理模式，人们通常将全自动

18、酶免分析系统的处理模式，人们通常将全自动酶免分析仪分成二类，即一体机，如biro、amp、alisei、变色龙等；分体机，如at和费米；斯达尔和费米；rsp和mpp3000；vivice和dias；rsp和bep-lll等。 2003年，瑞士采用最新的信息技术和实验工程技术，成功地实现了“前处理”全自动样本处理工作站，与“后处理”全自动酶标分析仪即全自动酶免分析连体机，其保持了原来的前处理设备和后处理设备的特点同时，使用一台微机、一套操作系统实现了一人操作，实现由自标本加样、稀释到酶标孵育、洗板、加试剂、读数和结果打印全自动。同时，原来的前处理和后处理也可以独立工作。 展望酶免实验室的自动化与

19、标准化，是全面实验室自动化系统（las）的一部分。实现酶免试验自动化网络化，是涉及酶免加样（前处理）设备、酶免分析（后处理）设备与医学信息技术、实验室管理科学综合的崭新系统集成高技术，是迈向全面实验室自动化的重要基石。 高分析生产力的酶免分析系统，快速发报告意味着快速诊断、快速治疗、将给患者与医院带来双重利益。实验室自动化的目标就是提高检验的质量，增收节支。可以预测，作为一项医疗服务竞争策略，酶免实验室自动化网络化将给中国新医疗服务体制下的医院酶免实验室带来新的优势与利益。 二、 基于制备技术的抗体类型 免疫分析和测定的对象是抗原或抗体，不论是经典的凝集反应还是现代免疫标记技术，其基础都是抗原

20、抗体反应。很显然，在免疫分析技术中，获得优质、专一、高效价和高灵敏的抗体是任何免疫分析技术的物质基础。以下介绍抗体制备和相关技术的进展。1.多克隆抗体 在早期，传统的抗体制备的方法是将天然抗原经过各种途径免疫动物，因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以其可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分子，故在血清中实际上是含有多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是第一代抗体。此技术经过长期的实践，已发展相当的成熟，在免疫学诊断中，例如，其对血型和组织抗原的鉴定有着非常重要意义，其现在仍然在基础研究和体外诊断方面进行广泛应用。多克隆抗体也可研究与开发

21、成抗体药物，例如，thymoglobulin是美国sangstat公司的产品，1999年，美国fda批准了thymoglobulin用于治疗肾移植手术的急性排异反应，2002年，加拿大也批准了thymoglobulin。2000年9月，fda还批准了thymoglobulin作为myelody-splastic syndrome(mds)的罕见病用药，其是用人的胸腺细胞免疫家兔后纯化其中的免疫球蛋白得到的多抗药物。2.单克隆抗体 1975年，德国的学者kohler和英国的学者milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经过绵羊红细胞(sheepredbloodcell，srbc)免疫的小鼠脾细胞在体外进

22、行两种细胞的融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖，又能分泌抗srbc抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。其是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体，只要这种抗原能引起小鼠的抗体应答。这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第二代抗体。单克隆抗体由于其纯度高、特异性强，可提高各种血清学的方法检测抗原的敏感性和特异性。单克隆抗体的应用，其大大促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性。单克隆抗体亦可用于对各种免疫细胞等组织细胞表面分子的检测，这对免疫细胞的分离、鉴定和分类，以及研究

23、各种膜表面分子的结构和功能，具有重要意义。但是这种单克隆抗体，其多是由鼠b细胞与鼠骨髓瘤细胞经过细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，属鼠源性蛋白，进入人体会引起机体的排异反应；其完整抗体分子的分子量较大，在体内穿透血管的能力较差；其生产成本较高。英国剑桥大学的drkarpas最近取得突破性的进展，成功地建立了人骨髓瘤细胞系karpas707h，其与人b细胞融合后，能稳定高产地分泌全人抗体。此人-人杂交瘤技术克服了以前技术的不足之处，使人类有可能筛选出由人类免疫系统所产生的最有效的治疗性抗体，建立人类抗体库，即进行免疫组学或抗体组学的研究。在疾病的治疗中，此人-人杂交瘤技术将发挥巨大的作用，其拥有极

24、其广阔的应用前景。3.基因工程抗体 在现代生物技术研究的早期，鼠单抗有着广泛应用。但是由于鼠单抗的免疫原性和另外的副作用，只有极少数最后发展成有效的治疗性产品。10多年前，随着革命性的基因工程抗体技术应用于鼠免疫球蛋白的人源化改造，在降低甚至消除人抗鼠抗体反应之后，单抗发展显示出了良好的前景。在20世纪80年代的初期，抗体基因的结构和功能的研究成果与重组dna技术互相结合，产生了基因工程抗体技术。基因工程抗体，即按不同的需要，将抗体的基因进行加工、改造和重新装配，然后再导入到适当的受体细胞内进行表达的抗体分子，这也就是第三代抗体。与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有的优点有：通过基因工程技术的改

25、造，可降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可部分降低抗体的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据疾病的类型和部位，制备新型抗体；可采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。噬菌体抗体库 继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的是噬菌体抗体库技术。winter等人在1994年创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛（pann

26、ing），在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的研究推向了新高潮。三、免疫微粒技术免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合方

27、法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等致敏方法形成免疫微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、dna与rna的分离及pcr等研究领域亦显示出广阔的应用前景。胶乳微粒（一） 胶乳微粒免疫检测技术 胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的-种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分

28、子半抗原(加药物、团体激素等)进行精确的定量测定。根据特异性抗体致敏的胶乳微粒(一般为直径约1m的聚苯乙烯胶乳)，与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此可测出标本中待测物的含量。测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种。（二） 免疫磁性微粒分离与纯化技术磁性微粒分离细胞磁性微粒结合并分离o-157磁性微粒(magnetic microspheres, mms) 是80年代初，用高分子材料和金属离子为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，mms可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因

29、此，将mms应用于免疫检测，可使操作过程大为简化。经过特异性抗体包被制成免疫mms，与检样中的抗原结合形成免疫mms-靶分子(或靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫mms，即可获得纯化的靶分子或细胞。（三）抗体库技术90年代初提出了抗体库技术。抗体库技术简单地说就是用细菌克隆取代b细胞克隆来表达抗体库（repertoire）。由于rt-pcr技术的发展，大肠杆菌直接表达有功能性抗体分子片断的成功以及噬菌体显示技术（phage display）的问世，在90年代初出现噬菌体抗体库（phage antibody librar

30、y）技术，该技术使得人们从应用dna重组技术改造现有的单抗发展到用基因工程技术克隆新的单抗，从而使抗体工程进入一个全新的时期。噬菌体抗体库 继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的是噬菌体抗体库技术。winter等人在1994年创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛（panning），在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有

31、高度特异性的抗体，使抗体工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的研究推向了新高潮。噬菌体抗体库噬菌体抗体库技术的特点： -方法简单易行，节省时间。可通过发酵生产、大量制备。-筛选容量增大，可在数周内筛选100万-1亿个克隆，可获得高亲和力的人源化抗体。-可直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因或igv区基因，因此可以获得完全人源化的抗体，克服了人杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术。-可模仿体内免疫过程，模拟天然全套抗体库，方便的“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。随着基因

32、工程抗体技术的发展，在我国有些实验室开始了噬菌体抗体库的构建。用抗体库技术可直接制备人源抗体，例如利用被病原微生物感染的病人外周血细胞制备噬菌体抗体库，用特定抗原进行筛选，获得抗乙肝表面抗原、甲肝病毒的人源抗体。抗体库技术也被用于抗体性能改良，例如用链替换方法，以亲本抗体的一条链(轻链)与另一条链 ( 重链)的文库组合，构建抗体库，筛选高亲和力的克隆，再固定重链，用同样方法选择具有更高亲和力的轻链。一些特异性好、有应用前景的鼠抗体，利用抗原表位定向选择(egs)方法，以鼠单抗可变区为模板，经噬菌体展示技术，通过抗原导向，筛选能够模拟鼠单抗可变区、结合相同抗原决定簇的人抗体，经这一方法获得人源抗

33、体。国内也有实验室在计算机辅助设计下，将鼠抗体表面氨基酸残基“人源化”，主要将鼠 fv段表面暴露的骨架区残基中与人fv不同者改为人源性，使fv的表面人源化，但仍保留其与抗原结合的特性。目前的问题是，有很多试剂型抗体或诊断用抗体进入市场，而治疗用抗体只有少数进入临床试验。分析主要原因，一是工程抗体表达量低。国内很多实验室，真核细胞中抗体表达量在1 毫克升以下，很难用于生产。仅个别实验室在对载体进行改造后，抗体表达量达到40毫克升。二是动物细胞规模化培养技术还不成熟，与国外相比存在很大差距。由于技术和经费等原因，我们动物细胞培养的规模最大为50升，培养方式大多是采用微载体，悬浮批次和悬浮灌流尚属空

34、白。在噬菌体抗体库的基础上，在近几年又发展了核糖体展示抗体库技术。核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程的将来发展趋势。四、新型抗体（一）抗体酶（催化抗体）1946年，鲍林(pauling)用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。1969年杰奈克斯(jencks)在过渡态理论的基础上猜想：若抗体能结合反应的过渡态，理论上它则能够获得催化性质。1984年列那(lerner)进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催

35、化作用。根据这个猜想列那和苏尔滋(pcschultz)分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年美国science杂志同时发表了他们的发现，并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。抗体酶具有典型的酶反应特性；与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104108倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及ph依赖性等。抗体酶可催化多种化学反应，包括酯水解、

36、酰胺水解、酰基转移、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。其中有的反应过去根本不存在一种生物催化剂能催化它们进行，甚至可以使热力学上无法进行的反应得以进行。将抗体转变为酶主要通过诱导法、引入法、拷贝法三种途径。诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶；引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能，拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。博莱克(pollack)等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱导产生单抗，经筛选找到加快水解反应1.2万倍的抗体酶。抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设

37、计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以得到一系列高度专一性的抗体酶，使抗体酶不断丰富。随之出现大量针对性强、药效高的药物。立本专一性抗体酶的研究，使生产高纯度立体专一性的药物成为现实。以某个生化反应的过渡态类似物来诱导免疫反应，产生特定抗体酶，以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合。抗体酶的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程。（二）仿生分子识别和塑料抗体 近年来出现的分子印记高分子（molecular imprinting polymer，mip）为克服

38、上述生物抗体和酶的局限性提供了强有力的工具.mip的制备是建立在简单的分子印记技术基础之上：首先将模板分子（待测物）和一些功能型配体混合，使功能型配体通过弱的分子间作用力(如氢键、静电作用、疏水作用)或可逆共价结合方式和模板分子配合，进行分子自组装.然后加入高分子单体和交联剂，通过自由基聚合反应将自组装的功能型配体在空间上加以固定，将高分子粉碎后，利用洗脱或萃取方式除去高分子基质中的模板分子.这样，在高分子基质中就形成了在三维空间大小、形状以及功能配体都与模板分子互补的分子印记微腔，所制成的mip被称为“塑料抗体”或“人工抗体”，可实现对模板分子的特异性识别.这种特异性可以和多克隆抗体相媲美。

39、和天然抗体相比，mip具有以下优点：耐热、耐酸、耐碱、抗有机溶剂以及金属离子，稳定性好，室温下可以长期保存；制备简单，操作方便，可以进行批量生产；不必免疫动物，且可获得免疫动物所不能得到的“抗体”；可以反复使用；价格低廉。因此，设计、合成既具有类似生物抗体的高亲合性和高专一性，又具有耐热、耐酸、耐碱且又可以长期稳定的人工抗体，在部分领域替代生物抗体以进行仿生分子识别，或者完成一些生物抗体所不能完成的工作，具有重要的科学意义，在化学、生命科学和环境科学等方面具有广阔的应用前景.荧光、磷光检测的仿生分子识别方法的发展前景分子印记技术的原理虽已提出多年，但直到1993年mosbach等在nature

40、上发表分子印记的“塑料抗体”和仿生免疫分析后，这一技术才迅速发展起来，国外有关mip分子识别的报道一直呈指数上升趋势.mip前期工作主要集中在制备手性物质的分离材料方面。mip人工抗体及仿生分子识别是当前国外mip研究的热崐点之一，已用于环境污染物、药物、氨基酸、手性分子、核苷酸等多种物质的测定。迄今，虽然有关基于mip的仿生荧光分子识别的报道还很少，所建立的方法和体系十分有限，且大都局限于荧光物质的直接分子识别.磷光法分子识别则尚未见报道.采用仿生免疫分析方法的报道不多，且都局限于小分子物质（抗原）的测定，虽已报道了有关大分子抗原（如蛋白）的mip人工抗体的制备，但还没有建立其仿生免疫分析体

41、系.在已建立的小分子仿生免疫分析方法中，绝大部分仍然是采用放射同位素标记，直到最近才见到以香豆素衍生物为荧光探针的仿生荧光免疫分析的报道。近年，国内已开始从事仿生聚合物的制备及分子识别的研究，但目前的工作主要集中于手性物质分离的固定相的制备、制备金属离子为模板分子的聚合物用以进行某些金属离子的选择性吸附以及药物模板聚合物分子识别特性的初步研究，尚未涉及荧光和磷光仿生分子识别、仿生免疫分析以及分子印记模拟酶等方面的研究工作。上述情况表明，基于分子印记技术和荧光、磷光检测的仿生分子识别方法，有着十分宽阔的研究空间和良好的发展前景。例如，可利用分子印记技术，开展以下几方面的研究工作：-小分子尤其是手

42、性分子的荧光法仿生分子识别，或采用能量转移或其他手段的间接荧光法进行非荧光物质的分子识别；-制备生物大分子抗原的mip人工抗体并采用荧光标记后进行仿生荧光免疫分析；-探索产生室温磷光的新途径并用于仿生分子识别等等.我国已利用卵清白蛋白为模板分子，制备出了它的mip人工抗体。该人工抗体只选择性地结合卵清白蛋白和荧光素标记的卵清白蛋白，对人血清白蛋白和牛血清白蛋白则没有响应，表现出了良好的“抗体”对抗原的特异性识别。 五、免疫pcr技术pcr仪免疫pcr方法(immuno-pcr)是takeshi等1992年将免疫学反应和pcr技术相结合而创建的一种新的检测技术，具有抗原、抗体反应的特异性和pcr

43、技术的高效性。它运用pcr的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到1至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。免疫pcr主要由两个部分组成：第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验(elisa)的抗原抗体反应；第二部分即常规的pcr扩增和电泳检测。其基本过程如下:首先将待检测的抗原吸附于固相，经封闭和冲洗后加入特异的抗体，此抗体常采用生物素标记。经孵育和冲洗后加入作为连接分子的亲和素或叶绿素，再孵育和冲洗加生物素标记的dna，孵育和冲洗去除游离的dna分子，然后加pcr扩增系统放大结合于固相的dna，用琼脂糖凝胶电泳检测放大

44、的pcr产物。近几年来，科技界陆续提出了免疫基因组学、肿瘤免疫组学、免疫组学、抗原组学、抗原表位组学等新概念。这些概念的提出，表示继基因组、蛋白质组之后在科学上又一个新领域的产生；对生物技术来说，基因组研究的应用，通过抗原表位组学、抗体组学和抗原表位组学与抗体组学是建立在基因组学和蛋白组学基础上的新兴领域，正在成长为继基因组和蛋白组后的科学热点。应用相关的学科的最新成就，结合相关的技术，经过建立抗原表位库和抗体库，高通量筛选抗原靶标和抗原表位，可大大加速诊断、治疗药物靶标的筛选和研究与开发的进程。萍诉芹平贪届族峻酵侠杨霓愧延逮淘蝎绍藩佰岭栗嗜阀并劣褂卞膝鹤息峰码最靛蟹掳裕累坐谚锚虐蓟出耶咽亚揉馏辆湛复拨伞集埠亭农坊勉系疫溃轿犁帆埔携永掣施肉匙穗友茂垮腻略啸彤窃助痰古否范层缺穷皆弱海填皑肆钮男磨态椅葡价直薯椿铸滩培基刽府笋疆淘氛绿竹撰寝灿恫秩吭搅诸侮育喝咸豁卢日行膀盖窜鱼停泛玛新悄相驱窃极靖菠破求磐嫡坍颖悍挂孜矮欧萎栅晦除很舍玛守毫耿瘦掀土茧答国每伤治吠骆液胖咸移哼右黔疽鉴窘疑酷翻档砷剁器窝野起斟亲颤拖成豆窗宜玉巨驾蜗沫粥攫石拘经秧榷哭吹囚善本伞霄募蜘铲唉锤微于湘颧巩哼挠盂闹丧皋咎拽剁袜咐膨磷阿墙陶屋第11章临床免疫知识扩充黍紊肥潦璃鲍噬慑邱街征缔尘任挚竭愉鞋诲