第五章病毒的遗传和变异

1、第五章 病毒的遗传和变异遗传与变异，是生物界不断地普遍发生的现象，也是物种形成和生物进化的基础。病毒的遗传变异，既有相符于一般生物的共同规律，又有它独有的一些特征。生物通过各种生殖方式繁衍种族，保证了生命在世代间的连续，这种世代间的连续叫做“遗传”（heridity），而在生物个体间出现的差异叫做“变异”（Variation）。在生物的生命活动过程中，没有变异，生物界就失去了进化的材料，遗传只能是简单的重复。没有遗传，变异不能累积，变异失去意义，生物也不能进化。因此研究生物的遗传与变异现象，深入探讨它们的本质，并利用所得成果，能动地改造生物，更好地为人类服务。第一节 病毒的遗传和变异特征一、病

2、毒的遗传特征1核酸是病毒遗传的物质基础。为DNA或RNA，目前已经能够由许多小型RNA病毒和某些DNA病毒提取感染性核酸，可以在感染细胞内产生具有蛋白衣壳和囊膜的完整子代病毒。由脊髓灰质炎病毒的核酸与考克赛基病毒的衣壳构成的合子病毒，其在感染细胞以后产生的子代病毒将是完全的脊髓灰质炎病毒。2DNA病毒和某些RNA病毒的基因组都由一个单分子的核酸构成，但某些RNA病毒的基因组由若干个单独的RNA片段亦即节段构成。3核酸传递遗传信息的作用在于核苷酸中碱基的排列顺序。由于病毒营无性增殖方式，故在核酸复制时能够产生完全相同于原核酸的新的核酸分子，从而保持遗传的稳定性。4病毒没有细胞结构，缺乏独立的酶系

3、统，故其遗传机构所受周围环境的影响，尤其是宿主细胞内环境的影响，特别深刻。加之，病毒增殖迅速，可在短时期内产生许多世代的大量后代病毒，变异的机率相应增高，这又决定了病毒遗传的较大的动摇性变异性。5病毒的蛋白质衣壳和脂质囊膜是在病毒遗传信息控制下合成或由宿主细胞的成分衍化而来，这一点不同于其它生物。这些成分虽然决定着病毒的抗原特性，而且与病毒对细胞的吸附有关，在一定程度上影响着病毒与宿主细胞或机体的相互关系，例如感染与免疫，但从病毒生物学的本质上来看，它们只是病毒粒子中次要的、附属的或辅助的结构。6病毒编码的蛋白质，既有病毒子的结构蛋白质，又有调节核酸或蛋白质合成的酶类，因此不能单纯根据病毒结构

4、蛋白质的多少来推算病毒子中的基因数。二、病毒的变异特征病毒变异是由于核酸辅基的排列组合发生了不同于原来状态的变化，也就是在核酸复制过程中，碱基因某种原因而发生位置或组成上的“错误”，例如置换、易位、重复、缺失等，因而产生了不符于原核酸分子的“错误”核酸。这类“错误”核酸，多数不再能够构成完整的病毒粒子，也不能继续进行自我复制。但是也有一部分“错误”核酸，不仅能够组成病毒粒子，而且在病毒粒子增殖时将这种改变了的结构遗传下去。这就是所谓的“突变”。碱基置换有时影响一个核苷酸，而引起的突变称为点突变（point mutation）。碱基置换是由于核酸碱基结构中的H原子从一个原子向另一个邻近原子转移，

5、从而可能发生不同的碱基配对，例如胸腺嘧啶中的N-3上的一个H原子可能转移到C-4上，从而改变C-4的酮基为烯醇基，并改变碱基配对，以致胸腺嘧啶可能与鸟嘌呤而不是与腺嘌呤配对。鸟嘌呤同样也可发生酮-烯醇变化，使其与胸腺嘧啶配对。碱基置换可分为转换和颠换两种情况。转换（transition）是一个嘌呤被另一个嘌呤替换或一个嘧啶被另一个嘧啶替换；颠换（transversion）即一个嘌呤被一个嘧啶替换或一个嘧啶被一个嘌呤替换。DNA复制中还可能发生缺失和重复。在DNA复制过程中，如果DNA聚合酶从母链上脱落，随后又附着于链上后面的一些位点继续复制，其结果母链的一小段DNA被遗漏，未起模板作用，最后造

6、成一段的缺失。如果DNA聚合酶脱落下来又附着于已经复制过的位点上去复制，结果造成重复。所有缺失和重复也是突变的主要原因。此外，碱基的易位和核酸片段的倒转等等，也可导致突变。1DNA病毒的突变类型，也相同地或类似地发生于RNA病毒。2突变并不是因适应于环境而发生的，因此应用紫外线、-射线、亚硝酸、羟胺以及其他诱变因素诱致的突变株，并不表现对上述理化学因子的抵抗力的提高。例如，Simizu等（1973）应用-射线处理西方型马脑炎病毒，获得一株形成小型蚀斑的变异株，但此株对-射线的抵抗力并不增高。但必须指出，环境条件对突变株呈现一定的甚至明显的选择作用：某些突变将因不能适应环境条件而消亡；某些变异株

7、可能因比原株更加适应某些环境条件而大量增殖。3病毒突变，有其发生的客观规律，决不像某些人描述的那样，是一种杂乱无章、捉摸不定的神秘现象。4与其他生物相似，病毒的突变率在10-5-10-8之间。某些DNA病毒，例如兔痘病毒的痘斑突变株的发生率可高达1%。这是因为该病毒核酸上1000个分散的遗传部分都可发生突变，因而总的突变发生率高达10-2。5流感病毒和口蹄疫病毒几乎可在每个流行期中出现新的变种或变型。这是因为感染动物机体已获得一定程度的免疫性，进入机体的再次感染病毒子大多不再能够增殖，只有少数具有不同抗原性的病毒子可能存活和进行适当的增殖，再经几个增殖周期而形成新的变种和变型。这是自然选择的结

8、果，称之为自然变异现象。这种现象也可发生于其它病毒，只是较不明显罢了。6RNA病毒的变异性不如DNA病毒稳定，容易发生回变，也称为返祖。所谓“回变”，就是新获得的变异性消失，原有的遗传性状得到了恢复。第二节 研究方法研究病毒的遗传变异，首先要有客观的鉴定指标和方法，因为只在有了这样的指标，才有可能判定病毒特性的改变情况。其次，作为研究对象的病毒株，当然必须纯化，只有这样才能排除假象，发现规律性的东西。一、病毒的纯化目前所谓“纯系”病毒，即克隆株（Clone），其实也是一个或几个病毒子的许多子代的集合体，而在这些集合体中可能又出现了新的变异。但因原种数量占压倒优势，在表现性状上仍可承认其为纯系。

9、动物病毒的纯系分离，即纯化，主要应用三种方法。1蚀斑分离法：又称空斑分离法。其理论基础是认为一个病毒子可以形成一个蚀斑。因此，根据蚀斑的大小、形状和色泽等性状，选择不同的代表进行移植传代，即有可能获得若干不同的纯系毒株。蚀斑是病毒子代在单层细胞上生长，呈现致细胞病变作用，细胞死亡而在单层细胞上形成的空斑。但实际上，一个蚀斑并非是一个病毒子的后代，必须反复多次的蚀斑分离，才有可能获得来自一个病毒子的“纯系”病毒。2病斑分离法：是利用痘病毒和某些疱疹病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成的病斑进行纯系分离，其原理和基本方法同蚀斑分离法。3终点稀释法：本法是在研究甲型流感病毒的O-D变异时最早创立的。应用鸡胚

10、羊膜囊分离甲型流感病毒时，第一代羊水病毒对豚鼠细胞呈现很高的凝集价，但对鸡红细胞的凝集价很低，称为“O”相。将第一代病毒作高倍稀释，相当于1/2 ID50的释释度终点稀释度（在8个鸡胚中2-3个感染），则第二代病毒仍保持“O”相，随后继续应用这种“终点”稀释度传代，一般可以无限地保持病毒的“O”相的性状。这是由于终点稀释时只有占多数的“O”相病毒粒子能够获得感染下一代鸡胚的机会，毒株性状因而保持不变。如果若分离“D”相病毒时，可将第一代病毒作低倍稀释后进行第二代羊膜腔传代，经多次传代后，使“D”相病毒数量相对增多后（在变异株病毒具有较高增殖能力和增殖速度的情况下，成功率将显著增加），随后再作终

11、点稀释分离方法。此种方法也可在细胞培养物中进行。终点稀释法目前已经广泛用于毒株纯化和变异株选育等工作，特别是在那些不能进行蚀斑分离或病斑分离的病毒。二、遗传指标鉴定病毒遗传变异特性的常用指标包括：（1）病毒粒子的形态；（2）抗原构造及血清学性状；（3）蚀斑或病斑的大小和性状；（4）致细胞病变（CPE）的特征；（5）病原性，包括感染范围和毒力；（6）对理化学因素的抵抗力；（7）对干扰素的敏感性。病毒的遗传变异特性，由其本身和子代病毒子表现出来。但是，表型相同的病毒，其遗传型（或称基因型）可能不同。相反，遗传型相同的病毒，又可因外界条件等的抑制影响而不充分地全部表现其特性。表型是遗传型和环境条件相

12、互作用的结果。故在病毒遗传变异的研究中，必须掌握正确的方法，并保证实验条件的严密性和恒定性，力求消除各种意外干扰，并可考虑采用病毒成分或核酸分子的杂交和交互复活等验证手段。三、重组、相补（互补）和表型混合1重组（recombination）：两个不同性状的病毒株在混合感染时，由于核酸某个或某些片段的交换，形成新的基因组合而出现“杂交”性状的子代病毒，这一现象称为重组。两个病毒株的病毒核酸发生重组时，先是发生断裂，随后则是断裂部的相互交换。在基因组分段独立的病毒，重组是某个或某些核酸片段的交换，结果是在一个衣壳内包含有来源自两个不同亲代的核酸片段。同种病毒的不同毒株之间容易发生重组，但重组现象也

13、可发生于不同种和不同群病毒之间，甚至病毒的核酸可与细胞的DNA重组，这可能成为细胞恶性变的原因。重组现象可能是自然界中病毒变异的一个重要原因。有人认为，流感病毒不同毒种或毒株之间发生重组，是出现变异型的原因之一。因在实验室内很易获得人与动物流感病毒的重组型。重组试验还是研究病毒遗传的一个重要手段，特别是了解病毒基因的排列组合及其与表现性状之间的联系等，也可能是培育或创造新毒株的一个有效途径。病毒的重组可分为三种情况：（1）将两个亲本株混合感染组织培养细胞或鸡胚以后，收获子代病毒，并作纯系分离，选育其中具有两个亲本株“杂交”性状的新毒株，即重组型；（2）重组现象发生于活病毒与灭活病毒之间，其重组

14、型子代病毒具备灭活病毒的某些性状，特称交互复活（Cross reactivation）；（3）在以同株灭活病毒大量感染敏感细胞时，有时竟会产生活的感染性病毒。一般认为，这是因为在灭活过程中，遭受破坏的病毒基因部位不同，发生了致死性变异。对个体来说，这些病毒子都已灭活，但在用其大量感染细胞时，由于取长补短，恢复了原毒株灭活前的所有基因结构而发生复活，这种现象特称多数感染复活（multiplicity reactivation）。这三种重组现象可以遗传下去，称之为真性重组或遗传性重组，而下述的相补和表型混合则只是蛋白质的互换或混合，而暂时改变表型并不遗传给子代病毒。2相补（互补）（Compleme

15、ntation）：同种（株）或异种（株）的许多病毒子在混合感染同一细胞时，可能会发生干扰现象或相补现象。前者即为一种（株）病毒的增殖抑制或干扰另一种（株）病毒的增殖；后者为一种（株）病毒的增殖促进另一种（株）病毒的增殖，甚至为另一种（株）病毒所必需。腺病毒和腺联病毒的关系是典型的病毒相补现象，这种现象在痘病毒中也有明显的例子。相补现象发现于同种病毒的不同毒株之间、异种病毒之间以及活病毒与灭活病毒之间。应用相补试验，可以发现病毒结构中的功能单位及其与表现型的关系。3表现型混合（Phenotypic mixing）：是指混合感染时由一种（株）病毒的遗传机构（核酸）与另一种（株）病毒的衣壳（和囊膜）

16、组合而成的病毒子，这一现象称为衣壳交换。这种衣壳（或囊膜）也可能是杂合的，就是由两种（株）病毒的蛋白亚单位混合构成。这种表型混合的病毒，其遗传性能与提供核酸的病毒相同，而其抗原性以及对细胞的吸附特性等，则与提供衣壳（和囊膜）的病毒相同。由于只是基因产物蛋白质的混合或置换，所以表现型混合的性状也只是暂时的，不能遗传的。第三节 诱变因素诱变因素或诱变剂，是指能够引起或促进病毒变异的各种理化因子。一、化学诱变剂按其作用可以分为两类。（一）在病毒增殖过程中呈现作用例如各种嘧啶或嘌呤的类似物，前者包括5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴脱氧尿核苷（5-BUDR）和5-氟脱氧尿核苷（

17、5-FUDR），后者如2-氨基嘌呤（2-AP）。这类诱变剂在病毒核酸合成过程中替代某些正常碱基而进入核酸结构。部分病毒因而灭活，另一部分病毒因此而发生突变。吖啶类化合物，如原黄素以及吖啶黄和吖啶橙等，则是由于能够进入于邻近两个嘌呤之间，在核酸复制时造成碱基增加或缺失的错误而导致变异。诱变试验时，可将这类化学剂直接添加于培养液中。现以5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤为例，说明嘧啶和嘌呤类似物的诱变机理。胸腺嘧啶的甲基被一个溴原子代替而成为5-溴尿嘧啶，两者在结构上十分相似。因此5-溴尿嘧啶较易代替胸腺嘧啶（T）而与腺嘌呤（A）配对。其结果，A-BU代替了正常的A-T配对。当5-BU从酮式状态转变为烯醇

18、式状态时，则与鸟嘌呤（G）配对而成G-BU，从而使原来的A-T转换成G-C。2-氨基嘌呤是腺嘌呤的结构类似物，能与胸腺嘧啶配对，但也可以呈现亚氨基形式而与胞嘧啶配对，因此也可诱发A-TG-C转换。（二）对病毒核酸直接呈现作用例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂。1亚硝酸：因脱氨作用，将核酸的氨基变成氧基而使腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）、鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）、胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）。（1）当AH时，在核酸复制时H优先与C配对，可以使A-T变成G-C。（2）当G变成X时，由于X优先与C配对，虽然不出现G-AA-T转换，但X-C本身是不正常的碱基对。当C变成U时，因U优先于A配对，所以使G-

19、C变成A-T。2羟胺及其衍生物：例如甲氧胺和甲基羟胺等只能与嘧啶类发生反应。对胞嘧啶主要呈诱变作用（最适pH为6.0），对尿嘧啶主要呈灭活作用（最适pH为910）。胞嘧啶的碱基配对因形成羟胺衍生物而发生改变，与腺嘌呤（A）配对，从而发生了G-CA-T转换，引起突变。3烷化剂：有甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、乙基磺酸乙酯（EES）、磺酸二甲酯（DMS）和硫酸二乙酯（DES）以及氮芥等。其主要作用是使病毒核酸中的碱基发生烷化。如果鸟嘌呤（G）被烷化，则其与糖的结构键被水解，嘌呤碱基脱落，造成核酸缺损，引起复制错误和紊乱，主要是发生G-CA-T转换。这类诱变剂可直接用以处理病毒悬液

20、或提纯的病毒核酸。二、物理诱变因子如紫外线、-线和-射线等也因扰乱或破坏病毒核酸的正常结构而使病毒灭活或导致突变。第四节 病毒的变异现象病毒变异，包括许多方面，例如毒力和抗原性的变异、蚀斑或病斑的变异以及对某些理化因子的抵抗力或依赖性的变异等。这些变异，不是孤立地独自发生的，而是互相联系和互相影响的。例如毒力不同的毒株，其在培养细胞中形成的蚀斑形态也常不同，它们的抗原组成也常有所差异等等。一、毒力变异毒力表示毒株或毒型间病原性的差异，具体表现为所能感染的动物、组织和细胞范围及其引起的症状、死亡率和病变程度。由自然界，例如由感染动物、媒介昆虫或污染物等分离的病毒株，毒力常常不同。在医学及兽医学上

21、常常利用弱毒株的选育来制造弱毒疫苗，预防病毒病。获得毒力变异株的常见方法有：1自然选育：是通过从自然分离的毒株中，经过选育而获得弱毒株，以此可用作疫苗毒株。2人工培育：常应用异种动物或异种细胞、同种动物细胞和诱变因素等，进行病毒弱毒株的人工培育。（1）是通过自然条件下不感染或不易感染的所谓异种动物或异种细胞的适应性变异，而获得弱毒株用作疫苗株，如兔化猪瘟毒株、兔化和鸡胚化牛瘟毒株、鼠化和兔化口蹄疫毒株、鼠化马瘟毒株，鸡胚化乙型脑炎毒株、鸡胚化狂犬病毒株，乙型脑炎病毒经仓鼠肾细胞、鸡胚成纤维细胞以及鸡胚传代，麻疹病毒经鸡胚成纤维细胞传代，犬肝炎病毒经猪胃细胞培养，牛瘟病毒经绿猴肾细胞培养等等，都

22、获得了弱毒株，但某些病毒的感染范围很窄，即使应用上述多代“强迫”接种方法，仍难适应在异种动物或细胞中增殖，也就无法应用这一手段达到减毒目的。这种适应性变异的机理有两种说法，一种认为是动物机体或细胞的选择性结果。也就是说，在原始毒种中原来就有少数或个别能够适应在新宿主内增殖的病毒子，在接种异种动物或细胞时活存下来，并进行相应增殖，以致随着传代次数的增加，病毒数量增多，而引起异种动物或细胞的感染症状或病变，乃至死亡。另一种说法认为，病毒的适应性差异与细菌对不易感动物体的适应性相似，是病毒在新的生活条件下，改变某些合成途径的结果。（2）应用同种动物细胞，例如将猪瘟病毒和牛腹泻-粘膜病病毒分别在猪白细

23、胞培养物和牛肾细胞中传代，也获得了弱毒株。但因敏感细胞缺乏选择性，病毒子不纯，故再应用蚀斑法或终点稀释法进一步加以纯化选育。应用诱变因素，从突变型中经过蚀斑法等纯化选育，来获得弱毒株。二、抗原变异目前所谓病毒的“型”，实质上是病毒抗原性差别的表现，常用补体结合反应、沉淀反应、红细胞凝集抑制反应以及中和试验等血清学方法予以鉴别。病毒抗原性的差别，是其抗原性变异的结果。那些具有许多“型”的病毒，大都是那些易于变异的病毒，流感病毒和口蹄疫病毒是其中最显著的例子。某些病毒，例如猪瘟病毒和牛瘟病毒，至今还没有发现有明显的抗原性差异，这可能与现用的鉴别方法不够敏感有关。如对以往认为没有抗原差异的乙型脑炎病

24、毒、东方型马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒以及狂犬病病毒，应用细致的血清学方法，特别是单克隆抗体技术，而区别出不同毒株间的抗原差异，甚至可据此分为不同的型别。在诱致抗原变异的各种因素中，免疫血清，即特异抗体，可能有特殊意义。使病毒在免疫动物或免疫人体中连续传代，或者应用次中和量的免疫血清与病毒混合，在鸡胚或组织培养细胞内多次传代，一般都较快获得抗原变异株。如上述，流感病毒和口蹄疫病毒等的抗原自然变异，可能也是病毒在部分免疫的人群或畜群中周转的结果。而新的变异株的形成，又将引起新的流行，进而改变人群或畜群的免疫状态，反过来又促使新的变异产生。病毒抗原变异除引起病毒在抗原类别上的差别外，还可能引起象

25、血凝能力的改变等。三、培养性状的变异所谓病毒的培养性状是指其在组织培养细胞或鸡胚绒毛尿囊膜上形成的蚀斑或病斑的形态和性质，实际上就是病毒所引起的细胞病变的性状。病毒的培养性状可随病毒和细胞种类的而不同，可受培养条件等因素的明显影响，但对于同一毒株的病毒，在一定的细胞和培养条件下其培养特性是相对稳定的，具有鉴别意义。1蚀斑的大小：决定于病毒的弥散和吸附率以及病毒在细胞内生长、成熟、释放的速度及其在细胞内外的死亡率等，但亦常随培养条件和培养时间而不同。蚀斑大小似乎与病毒的毒力呈现一定的平行关系。一般来说，同一种病毒的小型蚀斑株的毒力低于其大型蚀斑株。但必须指出，某些病毒在组织培养细胞上连续传代后，

26、由于对这种组织培养细胞的适应，蚀斑也有逐渐增大的趋势。因此，蚀斑大小与病毒毒力之间的所谓平行关系，只是相对比较而言的；同一种病毒在相同的培养代数和培养条件下产生的蚀斑，大型蚀斑的毒力一般地高于小型蚀斑。2蚀斑的色泽：蚀斑是透明的，还是混浊的？是带色的，还是无色的？这些变化主要决定于蚀斑及其周缘细胞的死亡与溶崩情况。蚀斑中的细胞完全溶崩时，蚀斑透明无色；蚀斑中残留较多的死亡细胞及病变细胞时，蚀斑混浊或呈白色。如蚀斑中存留较多的活细胞，则可能因着染中性红而使蚀斑呈红色。这样的红色蚀斑已经见于腺病毒、新城疫病毒和SV病毒的一个变异株。3蚀斑的形状：蚀斑是圆的，还是不规则的？蚀斑边缘是清晰的，还是弥散的？这与病毒的弥散率及其导致的细胞病变率有关。同一种病毒于相同条件下通常产生性状一致的蚀斑。因此，蚀斑性状的