[6]体细胞胚培养

1、第三节第三节 体细胞发生体细胞发生 体细胞胚胎发生是单细胞或一群细胞被诱导不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程。 植物体细胞可能均具有胚胎发育的潜力，而这种潜力只有在适宜的培养条件下才能被诱导表现出来。体细胞胚或胚状体体细胞胚或胚状体 离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。 其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用； 其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； 其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径（崔凯荣和戴若兰，2000）。 胡萝卜体胚

2、发生胚胎发生胚胎发生EmbryogenesisEmbryogenesis在愈伤组织表面或内部产生胚状体（体在愈伤组织表面或内部产生胚状体（体细胞胚，细胞胚，somatic embryo）的过程）的过程类似于合子胚的发生，有球形胚、心类似于合子胚的发生，有球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚四个时期形胚、鱼雷形胚和子叶胚四个时期球形胚球形胚心形胚心形胚鱼雷胚鱼雷胚子叶胚子叶胚体细胞胚体细胞胚的形成的形成直接发生直接发生间接发生间接发生固体培养固体培养悬浮培养悬浮培养在叶片上直接形成的体细胞胚体细胞胚从外植体上直接发生 早期体细胞胚 早期体细胞胚 叶片表面形成小的瘤状突起由瘤状突起发育形成的早期体细胞

3、胚兰草叶片体细胞胚直接形成的过程（引自Chen等,1999） 体细胞胚从外植体上直接发生 经过愈伤组织的体细胞胚发生 诱导外植体形成愈伤组织， 诱导愈伤组织胚性化， 体细胞胚形成。 但在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，通常可以直接诱导胚性愈伤组织直接诱导胚性愈伤组织产生，进而发生体细胞胚。因此，经过愈伤组织的体细胞胚胎发生，胚性愈伤组织胚性愈伤组织的形成是培养的关键。愈伤组织胚胎发生阶段培养基愈伤组织胚胎发生阶段培养基 较高浓度的2，4D的培养基中诱导愈伤组织产生，将愈伤组织转移到降低（1/2）2，4D浓度的培养基中使愈伤组织胚性化。在此培养基中已可见少数球形胚形成。胚性愈伤组织再转入胚胎发育培

4、养基中，体细胞胚很快大量产生。胚胎发育培养基应继续降低生长素的浓度，并提高细胞分裂表浓度。a. 质地紧密的愈伤组织b. 胚性愈伤组织c. 球形胚形成d. 子叶期胚蝴蝶兰茎段外植体经过愈伤组织的体细胞胚发生（引自Lin等，2000） 细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生 培养物中存在两种类型的细胞：培养物中存在两种类型的细胞： 一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般不具备胚胎发生潜力； 二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。 胚性细胞团在增殖培养基上可以连续增殖，其增殖方式是通过细胞增殖和细胞团离散进行的。 通过悬浮细胞系再

5、生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可以提高胚胎的生产效率。这一体系的关键是要建立适宜的悬浮细胞系 胚胎发生的优点胚胎发生的优点1.数量多；数量多；2.速度快；速度快；3.结构完整结构完整内因内因外因外因影响形态发生的因素影响形态发生的因素o基因型基因型o外植体的类型及生理状态外植体的类型及生理状态o 愈伤组织的生理状态愈伤组织的生理状态o培养条件培养条件o培养方式培养方式o培养基成分培养基成分百合鳞茎不同部位鳞片组织培养时百合鳞茎不同部位鳞片组织培养时再生能力的差异再生能力的差异项目项目外植体总数外植体总数产生小鳞茎的外植体数产生小鳞茎的外植体数%顶部顶部中部中部基部基部2600261

6、3.8946771.3愈伤组织的生理状态及遗传特性愈伤组织的生理状态及遗传特性1)愈伤组织在原培养基上生长的时间愈伤组织在原培养基上生长的时间2)愈伤组织继代的次数愈伤组织继代的次数q愈伤组织继代次数增加，形态发愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失生能力逐渐丧失REASONSv 生理生化方面的变化：如过氧生理生化方面的变化：如过氧化物酶活性和激素化物酶活性和激素v 非胚性细胞与胚性细胞竞争：非胚性细胞与胚性细胞竞争：18 chromosomesv遗传上表现不稳定：染色体出遗传上表现不稳定：染色体出现多倍体和非整倍体现多倍体和非整倍体培养条件培养条件光照光照温度温度气体成分气体成分培养密度

7、培养密度愈伤组织诱导需弱光或不需光，分化要光愈伤组织诱导需弱光或不需光，分化要光25-2825-28C C。在花药培养时对形态发生影响较大。在花药培养时对形态发生影响较大氧含量高利于愈伤组织和根的生长，低则利于胚胎发生氧含量高利于愈伤组织和根的生长，低则利于胚胎发生培养密度大不利于胚胎发生培养密度大不利于胚胎发生培养基成分培养基成分基本培养基基本培养基碳源碳源 高无机盐对胚生长有利：高无机盐对胚生长有利：MSMS培养基是高浓培养基是高浓度无机盐类培养基，是度无机盐类培养基，是WhiteWhite培养基的培养基的1010倍。倍。 钾对胚胎发生是必需的，尤其在氮低时钾对胚胎发生是必需的，尤其在氮低

8、时 缺铁时，体细胞胚不能从球心期发育成为缺铁时，体细胞胚不能从球心期发育成为心形期心形期 蔗糖是应用较广、对体细胞胚发生最有效蔗糖是应用较广、对体细胞胚发生最有效的糖的糖氮源氮源激素激素其它因子其它因子氮含量高有利于胚胎发生：氮含量高有利于胚胎发生：MSMS培养基是培养基是WhiteWhite培养基的培养基的2020培培硝态氮有利于愈伤组织的生长硝态氮有利于愈伤组织的生长生长素生长素/ /细胞分裂素：高促根，低促芽细胞分裂素：高促根，低促芽固化物种类、固化物种类、pHpH值值、渗透压等、渗透压等植物体胚发生的应用植物体胚发生的应用: : （1 1）证实植物细胞全能性的理想实验系统；）证实植物细

9、胞全能性的理想实验系统； （2 2）植物离体形态发生的主要途径，可广泛应）植物离体形态发生的主要途径，可广泛应用于离体繁殖、遗传转化等；用于离体繁殖、遗传转化等； （3 3）制作人工种子；）制作人工种子； （4 4）研究植物胚胎发育的理想模式系统；）研究植物胚胎发育的理想模式系统； （5 5）克隆许多目的基因的）克隆许多目的基因的“基因库基因库”（植物胚（植物胚胎表达的基因数量巨大，是所有器官中最多的）。胎表达的基因数量巨大，是所有器官中最多的）。WHATDONTWEKNOW?/content/vol309/issue5731/index.dtl

10、体胚发生机理依然不清楚：体胚发生机理依然不清楚：1212大未解之迷大未解之迷SCIENCESCIENCE， 20052005年年7 7月月1 1日第日第125125期期体细胞胚发生途径的思考体细胞胚发生途径的思考1、直接途径比间接途径更易获得体胚；、直接途径比间接途径更易获得体胚；2、植物体细胞胚的形成多通过间接途径产生，在、植物体细胞胚的形成多通过间接途径产生，在愈伤组织中某些体细胞可转化为胚性细胞，胚性愈伤组织中某些体细胞可转化为胚性细胞，胚性细胞继续分裂形成多细胞原胚以及不同发育时期细胞继续分裂形成多细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚，从而获得数量更多、再生率更高的的体细胞胚，从而获得数

11、量更多、再生率更高的体细胞胚和再生植株；体细胞胚和再生植株；3、直接途径比间接途径获得的再生植株稳定；、直接途径比间接途径获得的再生植株稳定；4、幼嫩的生殖器官作外植体易获得直接体胚，幼、幼嫩的生殖器官作外植体易获得直接体胚，幼嫩的营养器官作外植体易获得间接体胚；嫩的营养器官作外植体易获得间接体胚；5、直接途径获得体胚的时间比间接途径短。、直接途径获得体胚的时间比间接途径短。 植物激素对植物激素对SE的影响的影响（一）、（一）、2，4-D1、作用、作用 诱导体细胞发生的重要激素（ Jimenez ，2005），特别是单子叶植物，但诱导脱分化后必须及时降低或去掉，胚性细胞才能正常发育。2、依据、

12、依据宁夏拘杞(崔凯荣等，1998)：如不及时降低或去掉2，4一D，则胚性细胞也是不能正常发育。三叶草（ Parrott ，1991）：如不及时降低24一D，球形胚就产生次生胚，抑制体胚 正常发育。菊花（蒋细旺和张启翔 ，2007）：逐渐降低24一D，促进体胚形成。3、机理、机理2，4一D对基因表达调控具有时空特异性，能诱导特异性蛋白质产生。2，4一D的浓度与核DNA 甲基化有关，从而调控基因表达和体胚的发育。2，4一D是通过改变细胞内源IAA代谢而起作用。（二）、（二）、ABA1、作用、作用 ABA可明显地提高体细胞胚发生的频率与质量（ Jimenez ，2005）。2、依据、依据拘杞(崔凯荣

13、等，1998)：ABA 能促进体胚成熟，抑制体胚过早萌发, 并可抑制畸形胚产生。白云杉(Dung等，199)：ABA处理愈伤组织后提高了体胚发生频率。三叶草（ Parrott ，1991）：如不及时降低24一D，球形胚就产生次生胚，抑制体胚 正常发育。菊花（蒋细旺和张启翔 ，2007）：逐渐降低24一D，促进体胚形成。3、机理、机理ABA促进体胚结构正常化，抑制多种异常体胚的发生。对某些体胚发生特异基因表达起调控作用，产生合成贮藏蛋白、晚期胚胎发生丰富蛋白和胚胎发生特异性蛋白通过信号转道，ABA在转录和翻译水平上调控基因的表达并对体胚的发生和发育产生影响。ABA与作为第二信使的Ca离子结合，诱

14、导跟体胚发生有关的基因表达。3、还原性氮和外源氨基酸对、还原性氮和外源氨基酸对SE的影响的影响还原性氮是诱导SE发生的重要因素之一。适当提高培养基中NH4/ NO3的比例有利于体胚的分化外源水解酪蛋白或酵母提取物有利于SE发生。 培养基类型培养基类型外植体数外植体数/个个发生体胚的数发生体胚的数量量/个个体胚发生率体胚发生率/ %每外植体分化每外植体分化的体胚数的体胚数MSMS1501501391390 093930 04 47 a7 a13136 62 29 a9 aN N6 615015078780 052520 02 22 b2 b5 56 61 11 b1 bB B5 51501501

15、8180 011117 70 09 c9 c0 09 90 02 c2 c4、光照、光照（1）大多数观赏植物SE对光的变化不敏感。（2）有些观赏植物如菊花不同光照强度导致分化率和再生芽数的差异 极显著。暗培养时，没有胚性愈伤组织和再生芽产生，即不能完成间接体细胞胚的发生和分化；光照强度为500 lx 时，胚性愈伤组织能正常分化，分化率为73.5%，平均每外植体分化的芽数为12.1个；光照强度为1 0002 000 lx 时，胚性愈伤组织能正常分化，且分化率最高为92.7%，平均每外植体分化的芽数最高达17.8个，从而使茎段外植体能通过间接体细胞胚发生途径再生和成苗。光照强度超过3 000 lx时，茎段外植体易褐化，不能顺利完成间接体细胞胚的发生和分化。（3）间隔红光：处理24h内，可促进马利筋的SE（Torne等，1996）。4、SE、生物反应器与人工种子、生物反应器与人工种子人工种子人工种子：指通过植物组织培养方法获得的具有正人工种子：指通过植物组织培养方法获得的具有正 常发育能力的材料，外面包被特定的物常发育能力的材料，外面包被特定的物 质，在适宜条件下可以发芽成苗的植物质，在适