胶体金生产工艺配方原则PPT课件

1、1内内 容容一、和膜相关的配方和原理一、和膜相关的配方和原理二、和金子垫相关的配方和原理二、和金子垫相关的配方和原理三、和样品垫相关的配方和原理三、和样品垫相关的配方和原理四、相关问题四、相关问题第1页/共78页2一、和膜相关的配方和原理一、和膜相关的配方和原理电镜下的NC膜第2页/共78页3硝酸纤维膜生产工艺图硝酸纤维膜生产工艺图第3页/共78页4孔径定义的问题孔径定义的问题第4页/共78页5孔径对侧向层析速度的影响孔径对侧向层析速度的影响标称孔径 (m) 层析 4.5 cm 的时间 (sec) 3 245 5 185 8 140 12 100 第5页/共78页6不同种类膜的不同种类膜的 I

2、gG结合能力结合能力第6页/共78页7不同种类膜的不同种类膜的 BSA结合能力结合能力第7页/共78页8为什么蛋白会结合到膜上为什么蛋白会结合到膜上?结合力是什么? 静电 疏水力这两种结合力的效应是什么? 使蛋白从溶液中分离出来 长久结合作用第8页/共78页9 静电作用力静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用力 疏水作用力疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏水基团相互接近. 而形成的一种作用力。对维持分子的三、四级结构起着重要的作用。每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。第9页/共78页10 蛋白质疏水性状和亲水性状当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开在

3、外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水基团通过疏水作用力结合，达到固定的目的。第10页/共78页11蛋白结合到固相材料上蛋白结合到固相材料上 蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 取决于 蛋白溶液扩散到固相表面 蛋白从溶液中分离出来 蛋白吸附到固相上 蛋白重排到最低能态第11页/共78页12吸附过程吸附过程溶液中的蛋白蛋白转移到表面区域吸附蛋白在表面重排第12页/共78页13多位点结合多位点结合只有1个位点的结合是可逆的多位点结合使得蛋白稳定在固相表面，即

4、使其中的每个单位点都是可逆的第13页/共78页14影响蛋白结合的因素影响蛋白结合的因素 蛋白缓冲液 使用的膜 蛋白自身 应用体系 第14页/共78页15蛋白缓冲液蛋白缓冲液 没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别优化。 作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性,提高稳定性 定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越强蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越强”第15页/共78页16缓冲液的优化缓冲液的优化 离子强度 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度，蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度，溶液配制中就已会出现沉淀。 pH 蛋白在等电点最不稳定 沉淀剂 通常用醇降低蛋白的

5、稳定性，也可润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。 盐 通常不会影响 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 减少信号强度，消假阳第16页/共78页17 糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减缓老化速度，也可以增加亲水力。 惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 表面活性剂：增加亲水力，也可增色。第17页/共78页18缓冲液的基本成分缓冲液的基本成分各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等盐类：NaCl糖：蔗糖，海藻糖等表面活性剂：Tween20，Triton x-100等惰性蛋白：Casein等防腐剂 ：叠氮钠，卡松等第18页/共78页19推荐的起始缓冲液推荐的起始缓冲液 10mM Pho

6、sphate pH 7.0 3% Ethanol第19页/共78页20“潜水艇潜水艇” 效应效应 表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问题 因为使用的表面活性剂是水溶性的 喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了第20页/共78页21反应动力学 流速增加,反应速率减低 流速增加,检测时间缩短 流速增加,灵敏度降低 流速增加,试剂用量增加 流速增加,背景降低 距离增加,流速降低 孔径增加,蛋白结合量减少第21页/共78页22二、二、和金子垫相关的配方和原理和金子垫相关的配方和原理 和金子垫相关的工艺和配方有：1）标记工艺；2）金标稀释液3）金垫处理液第22页/共78页23标记工艺标记工艺 胶体金：一般指金

7、的水溶液，又称金溶胶。胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。-金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。其中分散的金颗粒直径一般在其中分散的金颗粒直径一般在1100nm之间，为负电荷分布。之间，为负电荷分布。第23页/共78页24高质量结合物高质量结合物单个分散的颗粒 圆形颗粒很少聚集这样得到的胶体稳定性和重复性好Cluster free, high quality gold reagentClustered, poor quality gold reagent第24页/共78页25胶体金的生产胶体金的生产 胶体金的形成是还原HAuCl4. HAuCL4

8、+ e- Au0 还原剂越强，得到的金颗粒越小 生产 40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠第25页/共78页26胶体金颗粒的形成胶体金颗粒的形成第26页/共78页27胶体金的生产胶体金的生产 2种重要步骤 直接形成 分步形成 大多数人用分步形成 比较容易控制颗粒大小，CV也比较小 能够生产出大颗粒胶体金第27页/共78页28颗粒大小对胶体的影响颗粒大小对胶体的影响第28页/共78页29蛋白标记原理蛋白标记原理蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依靠静电引力或蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固地吸附于胶体金颗粒表。由疏水力或共价键，被牢固地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋

9、白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使该胶联白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使该胶联溶液较为稳定。溶液较为稳定。第29页/共78页30要点要点蛋白的预处理 使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚集 合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价）搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速度第30页/共78页31盐滴定盐滴定 盐滴定不能衡量蛋白单层的形成 盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可以使胶体金稳定 pH和时间都会有影响第31页/共78页32蛋白邦定作用力蛋白邦定作用力 电荷作用力（静电作用力） 疏水力 共价键第3

10、2页/共78页33第33页/共78页34金标稀释液金标稀释液 合适的离子种类和强度，0.2M左右，常用有磷酸盐等。 大分子物质作为胶体金干燥后均匀散布的骨架，常用大分子物质如PEG4000，PEG20000，PVP 。 小分子物质对蛋白活性保护， 蛋白储存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各类低聚糖等，对产品的储存稳定性有帮助。第34页/共78页35 惰性蛋白，它是保护目的蛋白的活性，也维持胶体金的胶体稳定，它们是消除非特异性的封闭物质，也起着有分散胶体金颗粒的骨架作用。常用有BSA 、OVA、Casein。 表面活性剂，具有增加亲水性，促进结合等作用。常用的有Tween-20，Tritonx-100

11、。第35页/共78页36评价金标稀释液的参数评价金标稀释液的参数 金子释放程度及速度。 金标液稳定性。 灵敏度、特异性第36页/共78页37结合物释放垫的原理结合物释放垫的原理 什么是结合物释放垫? 孔径开放 快速层析 低蛋白结合力 理想的亲水性 传统材料是包被PVA的玻纤第37页/共78页38典型结合物释放垫材料的构意图典型结合物释放垫材料的构意图玻纤高分子PVA外壳第38页/共78页39侧向层析中结合物释放垫的原理侧向层析中结合物释放垫的原理 做什么用 (理论上)？ 让结合物完好无损的干燥 加样后让结合物快速释放 实际应用中 侧向层析中结合物释放垫可能遇到的问题比其它任何组分都多 第39页

12、/共78页40标准结合物释放垫的性能标准结合物释放垫的性能 45秒内释放出约 70% 的结合物 但是垫上保留的结合物降低了灵敏度，因为: 较少的结合物到达捕获线 较少的抗原到达捕获线 在侧向层析系统中 灵敏度要好 线条CV值一般在 15-20%第40页/共78页41储存于储存于 20oC时结合物释放率时结合物释放率第41页/共78页42金垫处理液金垫处理液 作用：增加亲水性作用：增加亲水性, 促进复溶促进复溶, 保持稳定性保持稳定性 基本成分：基本成分： 1）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物缓冲液等。生物缓冲液等。 2）表面活性剂：）表面活性剂：Twee

13、n-20，Tritonx-100等。等。 3）大分子物质：）大分子物质：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA 4）惰性蛋白：）惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）小分子保护物质：糖类物质，如蔗糖，海藻糖等。）小分子保护物质：糖类物质，如蔗糖，海藻糖等。 第42页/共78页43结合物释放常见问题结合物释放常见问题 释放不充分 释放慢 释放垫再次湿润困难第43页/共78页44释放不充分释放不充分 结合物绑定到释放垫上了 用聚合物和表面活性剂封闭释放垫 在储存过程中，结合物发生聚集 控制封闭剂的用量 控制溶液的离子强度第44页/共78页45释放慢释放慢 您的释放垫是怎样封闭的

14、? 是否加了亲水试剂？ 是否用了大量的蛋白? 是否用了大量的糖? 试纸条各组分之间接触紧密么?第45页/共78页46释放垫再次湿润困难释放垫再次湿润困难 您使用的是哪一种释放垫? 是亲水的么? 您是怎样封闭释放垫的?第46页/共78页47三、和样品垫相关的配方和原理 作用：改变样本PH, 调节爬速, 控制金标释放，抑制非特异性吸附,降低背景 基本成分： 1）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物缓冲液等。生物缓冲液等。 2）表面活性剂：）表面活性剂：Tween-20，Tritonx-100等。等。 3）大分子聚合物质：）大分子聚合物质：PEG4000，PEG2

15、0000，PVP，PVA 4）惰性蛋白：）惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）生物物质：鼠）生物物质：鼠IGg，抗红细胞抗体等。，抗红细胞抗体等。第47页/共78页48 血清类样品垫注意爬速，背景，灵敏度的达到和假阳的消除。 全血类样品垫1）必须能够去除红细胞！2）还需具备下列功能 不能造成溶血 不能干扰样品 分离必须快速高效 必须能够分离一定范围内的不同血样量 灵敏度的达到和假阳的消除第48页/共78页49 尿液类样品垫注意交叉反应的消除。第49页/共78页50影响抗原抗体反应的外部因素影响抗原抗体反应的外部因素 电解质 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电

16、解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。第50页/共78页51 酸碱度 蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质。抗原抗体反应一般在pH为69进行。第51页/共78页52 温度 抗原抗体反应必须在合适的温度中进行，一般以1540为宜，最适反应温度为37。某些特殊的抗原抗体

17、反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20以上反而解离。第52页/共78页53 反应时间反应时间越长，抗原抗体反应越充分，显色也越深。所有调整辅料的思路都可从抗原抗体反应的影响因素和辅料的成分性质进行考虑和设计。第53页/共78页54四、相关问题四、相关问题 假阳问题 假阴问题 稳定性问题 上样问题第54页/共78页55（一）假阳问题（一）假阳问题未标记上的金颗粒（裸金）电荷作用疏水作用硫醇类物质的存在（S-H键起作用）抗原抗体作用（内源性物质）抗凝剂和防腐剂的影响其他原因第55页/共78页56未标记上的金颗粒（裸金）未标记上的金颗粒（裸金） 裸金聚集，周围具有大

18、量的负电荷，当样本爬过金垫，裸金随着向上跑，在T线位置只要碰到带有正电荷的蛋白，即发生反应，形成假阳线条。 解决方法：检查标记过程，BSA封闭第56页/共78页57电荷作用电荷作用 胶体金颗粒带有负电荷，当遇上带有正电荷的蛋白，易发生非特异性结合反应，导致假阳。反应环境为酸性时，已发生此类结合。 解决方法：改变pH和盐度第57页/共78页58疏水作用疏水作用 抗原抗体结合以及和胶体金结合都需要用到疏水作用力，当反应环境中存在疏水物质时，易和胶体金或抗原抗体通过疏水作用力结合，产生假阳结果，如标本里的一些脂肪，细胞碎片，细菌等等。 解决方法：用表面活性剂或亲水聚合物进行处理。第58页/共78页5

19、9抗原抗体作用抗原抗体作用 此类作用是指标本里面含有能和标记材料/包被材料发生免疫反应的非目标物的其他物质导致的假阳结果。常见的有毒品的交叉反应，如KET试剂检测美沙酮标本，呈现阳性反应，就是美沙酮和KET材料发生了交叉反应；又有SG试剂中的抗鼠抗体反应等等。解决方法：在样品垫或金子垫或硝酸纤维素膜上加入相应的抗体，将这类物质在T线前消除掉。第59页/共78页60在血清检测中的具体非特异性反应物质在血清检测中的具体非特异性反应物质 大约40%的人血清标本中含有非特异干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗

20、体、交叉反应物质和其他物质等。第60页/共78页61 类风湿因子 人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：(1)用F(ab)2替代完整的IgG；(2)标本用预先热变性(63，10min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效)；(3)检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。第61页/共78页62 补体 如果在包被和标记过程中，使用的抗体的FC段的补体Clq分子结合位点被暴露出来，从而易使Clq可以将补体和抗体二者连接起来，造成假阳性现象。解决的方

21、法是：(1)用EDTA稀释标本；(2)用53、10min加热血清使Clq灭活。第62页/共78页63 嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig(s)结合的天然嗜异性抗体，易和包被和标记的抗体产生反应，能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ig(s)，但加入量不足或亚类不同时无效。第63页/共78页64 医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体（嗜异性抗体的一种）临床开展的用鼠源性CD3等克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig(s)抗体。解决的方法是：测

22、定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ig(s)，从而克服由于上述原因造成的假阳性。第64页/共78页65例子：Sg采用了双抗体夹心的方法进行检测，包被材料和标记材料都是单克隆抗体，属于鼠IGg类别，由于人体经常和动物打交道，体内易产生嗜异性抗体，如抗鼠抗体，抗牛抗体等等，这类嗜异性抗体极易导致假阳反应的产生。第65页/共78页66为了消除嗜异性抗体的影响，可通过在样品垫中加入正常的动物血清或纯化的鼠IGg，又或者在膜上喷有鼠IGg A线，金子中加有正常的动物血清或纯化的鼠IGg等等方式将嗜异性抗体排斥在T线前，消除这方面的假阳。第66页/共78页67 嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。解决的办法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。第67页/共78页68 交叉反应物质类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原测定簇正好是所用单克隆抗体相对的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。第68页/共78页69抗凝剂和防腐剂的影响抗凝剂和防腐剂的影响 抗凝剂(如肝素、EDTA、枸橼酸钠)，防腐剂(如NaN3)因为对离子和蛋白活性的影响，有时会导致假阳的产生。第69