色谱柱的选择博纳艾杰尔科技PPT课件

1、影响C18色谱柱性能的主要因素色谱柱与色谱填料的特性1、 柱填料 硅胶纯度 粒径 比表面积 孔径2、 色谱柱的构型 色谱柱直径 色谱柱长度3、 固定相 键合类型 残余硅羟基的影响 反相键合相的保留行为 键合硅胶的稳定性物理因素物理因素化学因素化学因素第1页/共30页柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对色谱柱性能的影响第2页/共30页柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I2.3-二羟基萘OHOHOHOH2.7-二羟基萘 min01234567mAU 010203040 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091702.D) 3.008 4.084min0123456m

2、AU 01020304050 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07090605.D) Area: 253.288 2.275 Area: 400.399 2.889min01234567mAU 0510152025303540 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091208.D) 2.450 3.471min0246810mAU 510152025 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091202.D) 3.944 Area: 176.686 5.934TF=1.31Brand W, AQ Column 5m

3、, 4.6mm150mm Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm min0123456789mAU 010203040 VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091711.D) 2.899Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流动相： 甲醇：水=65：35流速： 1 mL/min温度： 35检测波长： 230 nm 进样量： 20 L

4、硅胶纯度金属含量第3页/共30页柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II 硅胶纯度金属含量d第4页/共30页柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响第5页/共30页柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m，3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高. 第6页/共30页柱填料对C18色谱柱性能的影

5、响：比表面积 l 每克填料的表面积，与粒度，孔径有关l 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)l 根据需要选择合适的比表面积第7页/共30页柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I l 多孔材料的多孔材料的95%以上表面以上表面在孔内部在孔内部l 样品分子直径小于平均孔样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部径，才能进入微粒内部l 孔径至少是样品流体学直孔径至少是样品流体学直径的径的4倍倍l 300孔径用于：超过孔径用于：超过50个个氨基酸的肽或氨基酸的肽或25个残基的低个残基的低聚寡核苷酸聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部第8页/共30页柱填料对

6、C18色谱柱性能的影响：孔径II 小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大条件： C8色谱柱，4.6150mm，3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈水中；20min梯度，1030%B；60C，1.5ml/min第9页/共30页色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响第10页/共30页色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测

7、器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高第11页/共30页固定相对色谱柱性能的影响固定相对色谱柱性能的影响第12页/共30页固定相对色谱柱性能的影响：键合类型A 纵向交联：纵向交联：保留和选择不稳定B 横向交联：横向交联：宽pH适用，Durashell，C 单体键合：单体键合：重现性好，柱效高D 单体（空间保护）：单体（空间保护）：低pH稳定（Venusil ASB）第13页/共30页固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响残余硅羟基的影响残余硅羟基的影响普通硅胶普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法解决方法封尾双

8、层表面修饰第14页/共30页固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响封尾封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：缺点：不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pHC3C1，长链之间差别不大 第20页/共30页固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为不同厂家色谱柱的保留值，选择性与峰型色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰 T0（尿嘧啶）P: 吡啶L: 苯酚N: N,N-二甲基苯胺B: 4-丁基苯甲酸J: 甲苯第21页/共30页固定相对色谱柱性能的影

9、响： 键合硅胶的稳定性键合硅胶的稳定性键合硅胶的稳定性 低pH值，键合相流失 高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现 第22页/共30页固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性低pH值，键合相流失第23页/共30页固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性空间位阻保护，延缓键合相流失空间位阻键合代表产品：Venusil ASB C18Zorbax SB C18第24页/共30页固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性高pH值，硅胶基质溶解pH9时，色谱柱的稳定性第25页/共30页固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性碳杂化，延硅胶缓高pH值水解表面碳杂化Agela Durashell RP表面碳杂化示意图第26页/共30页博纳艾杰尔为您提供全面的LC解决方案 2010版药典LC方法开发服务 全面的色谱柱选择 低pH条件色谱柱（pH=0.8） Venusil ASB C18 高pH条件色谱柱（pH=1-12） Durashell C18 亲水色谱柱 Venusil MP C1