羟基喜树碱半固体脂质纳米粒制备工艺探究

1、轻基喜树碱半固体脂质纳米粒制备工艺探【摘要】 目的制备軽基喜树碱的半固体脂质纳米 粒(hcpt-ssln) o方法在单因素考察的基础上，通过正交设 计优选处方和制备工艺，并对优化条件下制备的hcpt-ssln 纳米溶液进行质量评价。结果制备的hcpt-ssln平均粒径为 130.5 nm,多分散系数为0. 18,载药量为2.51%,包封率 为79. 19%, 2电位为-33. lmv；纳米溶液41下放置6个月， 纳米粒外观、粒径及包封率无明显变化。结论所制备的 hcpt-ssln包封率和载药量较高，粒径分布均匀，稳定性良 好，为释基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。【关键词】務基喜树碱；半固

2、体脂质纳米粒；制备工 艺abstract :objectiveto preparehydroxycamptothecin semisolid lipid nanoparticles (hcpt-ssln). methodsbased on the single-factor experiment, the hcpt-ssln was prepared by orthogonal design for optimization of formulation and technology. then the obtained ssln was evaluated. resultsthe mean

3、particle size of the prepared hcpt-ssln was 130. 5nm, polydispersity index(pi) was 0.18, drug loading(dl) was 2. 51%, ent rapme nt efficiency (ee) was 79.19%, e potential was -33 lmv； placed at 4°c for 6 months, the appearance, particle size and entrapment efficiency of ssln were all stable. co

4、nclusionthe hcpt-ssln has high entrapment efficiency and drug loading, tmifonn particle size, good stability, which provides an extensive prospect for clinical application of hcpt.key words： hydroxycamptothecin； semisolid lipid nanoparticles (ssln)； preparation纳米粒载药系统自1976年由birrenbach首次报道以 来，由于其具有可生

5、物降解、低免疫性、有一定靶向性且制 剂形式多样化等优点，至今已取得很大发展1。固体脂质 纳米粒(solid lipid nanoparticles, sln)是粒径为 50 looonm的新一代亚微粒给药系统2,它能将药物包裹于类 脂核中而使药物稳定性增加，并具有缓控释、靶向、低毒等 优点。務基喜树碱(hydroxycamptothecin, hcpt)是拓扑异 构酶i (topo- i )抑制剂35。它抗瘤谱广，且无交叉耐 药性，目前已作为临床一线用药。但因其特殊的理化性质： 水不溶脂难溶、内酯环结构不稳定等因素，使得目前临床应 用受到了限制6。本研究在单因素考察的基础上，通过正 交设计优选

6、处方和制备工艺，以固体脂质和液体脂质混合物 为载体材料制备hcpt的半固体脂质纳米粒（semisolid lipid nanoparticles, ssln）,并对优化条件下制备的 hcpt-ssln纳米溶液进行了质量评价。1仪器与试剂unicam uv500紫外分光光度计（英国thermo spectronic公司）；激光粒度仪-3000hs （英国malvern instruments ltd）；冷冻干燥机（labconco freezone 12l）； jem-2010透射电子显微镜（tem） （ 0本株式电子会社）;tmp-1 型电子天平（德国sartorius公司）。10-軽基喜树碱

7、原料药（含量98%,四川广汉市生化制 品有限公司）；palmitic acid（十六酸，汕头市西陇化工厂）； dynasan 118（三硬脂酸甘油酯,sasol） ； corn oil （玉米油， sigma）；注射用大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司）； solutol hs 15（聚乙二醇 15 羟基硬脂酸醋,basf）；cremophor el （氢化蒐麻油，basf） ； peg-8-辛酸癸酸甘油酯 （gattefosse）；辛酸/癸酸三甘油酯（浙江兰溪物美化工有限 公司）；泊洛沙姆188（sigma）；卖泽myrj 59、节泽brij 53（sigma）,其它试剂均为分析纯；双蒸水用前

8、经0. 45 um 微孔滤膜过滤。2方法2. 1 hcpt-ssln的制备采用乳化蒸发-冷却固化法制备 hcpt-sslno称取一定量的hcpt、脂质、卵磷脂共溶于适量 有机溶剂中制得有机相，另称取适量表面活性剂溶于水中制 得水相，在751水浴下，将有机相匀速注入水相中，避光恒 温搅拌，挥干有机溶剂并浓缩至一定体积，将此半透明乳液 快速分散于适量lc冰水中继续搅拌固化0.5 h,经0.8 um 微孔滤膜过滤，即得hcpt-sslno以纳米粒的外观、粒径、 包封率为考察指标，分别考察了有机溶剂种类、有机相种类、 表面活性剂种类、固态脂质/液态脂质摩尔比、药脂比、有 机溶剂用量、表面活性剂浓度、水

9、相与油相中表面活性剂比 例、乳化过程中水相与油相比例、有机相注入水相速度、乳 化蒸发搅拌时间、搅拌速度等单因素的影响。2.2正交设计优化hcpt-ssln的制备工艺在单因素实 验考察的基础上，选择药脂比(a)、固态脂质与液态脂质的 摩尔比(b)、表面活性剂浓度(c)3个因素，每个因素选择3 个水平，按正交设计表l9 (34)实验。以包封率为指标，按 正交结果拟定的最佳处方和工艺制备3批样品，对制得的 hcpt-ssln进行质量评价来对优化结果进行验证。2. 3 hcpt-ssln冻干粉的制备按2 ml/瓶将hcpt-ssln 分装在7 ml的西林瓶中，每瓶中加入4. 0%的乳糖，搅拌使 完全溶

10、解，放入冷冻干燥机，按照0.5oc/min降温至-3qc 并维持24 h,在冷凝器低温、干燥箱保持一定真空度条件下, 按照0. 07, 0. 04, 0. 07°c/min三阶段升温至25°c,保温10 h,取出样品，压盖处理，即得hcpt-ssln冻干粉剂。2.4 hcpt-ssln纳米溶液的质量评价2. 4. 1形态、粒径分布和2电位测定取hcpt-ssln 适量，稀释，滴加在覆盖碳膜的铜网上，室温(25t)下以2. 0% 的磷鹄酸钠液负染，透射电镜下观察粒径大小和形态。取hcpt-ssln适量，稀释，波长633 nm处malvern 激光粒度仪上测定其粒径和4电位。2

11、. 4. 2 hcpt的含量测定精密称定1. 0 mg hcpt置50 ml 量瓶中，用ph 12.0 naoh溶液(0.01 mol/l)配制浓度为20 u g ml-1的溶液作为贮备液。紫外扫描结果表明其最大吸 收波长为414 nm,且所有辅料在该波长处的紫外吸收对测定 结果无干扰。另取贮备液分别配制浓度为0.2, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 ug ml-1 的溶液，以其在 414 nm 处 的吸收光度a为纵坐标，浓度c为横坐标，得标准曲线方程: a = 0. 067 8c+0. 001 3(r = 0. 999 9),表明 hcpt 在 0. 210. 0

12、 ugrnl-l浓度范围内线性关系良好。样品处理方法：取1.0 ml hcpt-ssln用ph 5.0 pbs 液稀释定容至25. 0 ml,取其中1.0 ml于试管中，加入一定 量的氯仿和ph 12.0 naoh溶液，涡旋混匀离心，取上清液 于414 nm处测定吸收光度。另取ph 5. 0 pbs液1.0 ml,同 法操作得空白对照品。回收率测定：取hcpt贮备液配制浓度为0.4, 4.0, 8.0 pg ml-1 的溶液，各取 1.0 ml,用 ph 12.0 naoh 溶 液稀释到5. omlo另取1.0 ml空白纳米粒混悬液，用ph 5. 0 pbs液稀释定容至25. 0 mlo取1.

13、0 ml分别加入上述3种浓 度的溶液中，按“2. 4.2”项下方法处理后测定，各浓度组 重复3次。2. 4. 3包封率(ee)测定包封率(ee)指被包封于纳米 粒中的药物含量与投药总量的比值。精密吸取1.0 ml hcpt-ssln 混悬液上样于 sephadex g-50 柱，以 ph5. opbs 液 洗脱，洗脱速度为1 ml min-1，收集乳白色流分，取1. 0 ml 按“2. 4. 2”项下方法处理，测定包封在脂质体内的hcpt浓 度c1；另取1. omlhcpt-ssln混悬液，加ph5. opbs液稀释到 25.0 ml,同法测定脂质体制剂中的hcpt浓度c2 , ee=cl/c

14、2x100%o2. 4. 4载药量(dl)测定载药量(drug loading coefficient, dl)系指纳米粒中所含药物量占制剂总量的百 分率。即dl二投药量xee /hcpt-ssln冻干粉总量x100%。2. 4. 5稳定性考察取适量hcpt-ssln纳米溶液分别置 于室温(25°c). 条件下放置6个月，考察其稳定性。观 察项目为外观、形态、粒径及包封率。2. 5统计学处理数据采用spss12. 0软件处理，±s表 示，p&lt；o. 05时有显著性差异。3结果3.1单因素考察在文献调查及单因素考察的基础上 可知：hcpt是主药；十六酸、三硬脂酸甘

15、油酯、玉米油是基 本脂质膜材；大豆卵磷脂一有乳化作用，能增加脂质膜的稳 定性，防止药物渗漏；二有抗氧化作用，防止hcpt和脂质 氧化；还有脱模、降低粘度及分散作用等；solutol hs 15 主要作为稳定剂和分散剂；丙酮和乙醇有利于溶解各种脂质 材料，并维持hcpt内酯形式；因而最后筛选出来的基本处 方组成为：hcpt、十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油、大豆 卵磷脂、solutol hs 15、丙酮和乙醇。另由考察确定以下参数：表面活性剂为solutol hs 15： soya lecithin为1 ： 1,有机相溶剂采用12 ml丙酮： 6 ml乙醇，水相与油相比为1.5/1,有机相注入水相

16、选定2.0 ml/min的滴速，搅拌速度为800 r/min,乳化蒸发搅拌时间 为2h。此外，固态脂质与液态脂质的摩尔比对包封率影响明 显，2/1时包封率最高，将其范围定为1/24/1；药脂比对 包封率和粒径影响明显，1/8时制备工艺不稳定，将其范围 定为1/401/15；表面活性剂过少则不能制备，过量易引起 粒子聚合，故将其浓度范围定为1.5%5%；这3个因素仍 需进一步考察优化。3.2正交设计实验因素和水平见表1,正交设计表 及结果见表2,方差分析结果见表3。表1因素水平（略）表2正交设计hcpt-ssln的结果（略）表3 f检验的结果（略）由表2可见，各个因素不同水平对ssln包封率的影

17、 响由大到小依次为：a1>a3>a2, b2>b3>b1, c3>c2>c1； r为极差值，rc>rb>ra,即表面活性剂浓度对ssln的包封 率影响最大，其次是固态脂质与液态脂质的摩尔比，再次是 药脂比；当表面活性剂浓度为5%时，包封率均在70%以上; 而当表面活性剂浓度只有3%时，包封率几乎都不超过55%； 为了保证药效，包封率是关键性指标，故我们选取a1b2c3 为最佳处方条件，即药脂比为1：20,固态脂质与液态脂质 的摩尔比为2 : 1,表面活性剂浓度为5%,例如，以投药量 10mg计算，需十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油各66. 7mg,

18、 大豆卵磷脂和solutol hs 15各450 mg。由表3可见只有c因素的f值大于f0. 05(2,2),说 明只有表面活性剂浓度对包封率的影响有统计学意义，为主 要影响因素，其次为固态脂质与液态脂质的摩尔比，再次是 药脂比。经验证，3批样品平均包封率为81.43%。3. 3 hcpt-ssln纳米溶液的质量评价3. 3. 1形态、粒径分布测定所制备的hcpt-ssln混悬 液为均一、稳定的半透明状分散系，体系略带淡蓝色乳光。 激光散射法测定3批样品的平均粒径为(130.5±14.41)nm, 多分散系数为0. 18,说明粒径分布均匀；透射电镜观察结果 表明，纳米粒为圆整的球状体

19、，无明显团聚现象。对电镜所 拍摄的粒径数据(n=502)采用sas软件进行正态统计分析， 结果粒径呈非正态分布，结果见图1。图1 hcpt-ssln的tem图(原放大倍数：x5 000x 3. 3.2 4电位测定4电位与纳米粒体系的稳定性密切相关。测定e电位可以预测纳米粒的储藏稳定性。3批纳 米粒2电位平均为(-33. 1±3. 30 ) mv,见表4。4 hcpt-ssln的粒径、2电位、包封率和载药量的测定结果(略)3. 3.3包封率、载药量和回收率预实验表明pbs液(ph=5. 0)能完全洗脱脂质体，但对游离hcpt无洗脱能力，故 该测定方法可靠。测得包封率为(79. 19&#

20、177;2. 78) %, rsd为 3. 51%,载药量为(2.51±017) %，rsd 为 6. 69% (见表 4)o 平均回收率为(100. 31±1 14) %, rsd 为 1. 14%o3. 3.4 ph 3批样品用ph计测定，ph值分别为6. 26,6. 29, 6.31,平均(6.29±0023), rsd 为 0.366%。3. 3.5冻干粉的水分散性及粒径分析冻干粉样品呈 现白色疏松块状，注射用水及生理盐水中分散性良好。另取 少许粉末，同“2.4.1”项下操作，malvern测得平均粒径为 (138. 9 + 15. 28) nmo3. 3

21、. 6稳定性考察hcpt-ssln纳米溶液于室温(25。0 避光放置6个月后，出现了霉菌、絮状或胶状沉淀，黄色药 物结晶析出等现象。4£条件下避光放置6个月后，无沉淀 及药物结晶析出，为均一、稳定的半透明状分散系，且测得 平均粒径为(141. 8±7. 84)nm,包封率为(77. 29±1.63) %, 表明在4£条件下该制剂的稳定性要比常温下好。4讨论hcpt的溶解性较差，在正辛醇中的表观溶解度是其在 蒸馆水中的27.2倍，hcpt还能插入磷脂酰基链中，有一定 亲和力7。其常见临床用量为515mg/d,故以大量脂质 来包封少量hcpt是可行的。固体脂

22、质纳米粒的制备方法很 多，因为hcpt不溶于水，与磷脂有一定的亲和力，当hcpt 溶于有机溶媒后与水溶液接触时，hcpt即大量析出。鉴于此 性质，采用乳化蒸发法较好，推测制备原理是使hcpt在高 速搅拌过程中进入熔化的脂质液滴，插入磷脂双分子层中而 被脂质核包封，内外水相中的游离药物有部分吸附在脂质核 表面，这样制备的纳米粒有较高的包封率，但具体脂质与 hcpt的作用关系还需进一步研究。hcpt在液体脂质中的溶解度比在固体脂质中大，引入 液体脂质可增大其包封率，因此在固体脂质载体中引入corn o订制备ssln,液态脂质的加入还能延缓固态脂质由a晶 型向b晶型的转化和减少药物的渗漏8。本实验选

23、择已正式收入欧洲药典的solutol hs 15作 为水相中的表面活性剂，因为和其他非离子表面活性剂相 比，它除了具有更好的增溶稳定性，更低的机体代谢毒性， 还在体外抗表皮样癌实验中表现出明显的抗多药耐药性，被 认为是一种潜在的抗肿瘤治疗因素9,目前被广泛应用于 静注、口服等多种剂型的辅料。单因素考察结果也说明它能 有效增进hcpt的溶解性，增加ssln包封率和稳定性。通过考察诸多对hcpt-ssln粒径和包封率有影响的单 因素，本实验筛选出药脂比、固态脂质与液态脂质的摩尔比、表面活性剂浓度为制备的3个关键要素，并通过正交设计获 得了优化工艺和处方，但方差分析结果说明只有表面活性剂 浓度对包封

24、率的影响有统计学意义，故还存在对包封率、粒 径影响较大的其它因素，有待进一步研究。通过质量评价，本实验所制备的hcpt-ssln包封率和 载药量较高，粒径分布均匀，稳定性良好，为餐基喜树碱的 临床应用提供了更广阔的前景。【参考文献】1 杨绮华.药物载体系统的研究进展j 中 国新药杂志，2002, 11 (8)： 593.2 王建新，张志荣.固体脂质纳米粒的研究进展 j.中国药学杂志，2001, 36(2):73.3 iyer l, ratain mj. clinical pharmacology of camp tot hecins j . cancer chem ot her parmacol, 1998, 42:31.4 urasaki y, laco g, takebayashi y, et al. use of camptothecin-resistant mammalian cell lines to evalua te the role of to poisomerase i in th