重组工程菌的培养

1、重组工程菌的培养基因工程菌的培养工艺基因工程菌的培养设备西华师范大学生物技术 2012级11班 制作： 1-16号演讲：基因工程菌的培养工艺影响因素培养基的影响培养基的影响诱导表达程序的影响PH的影响接种量的影响温度的影响溶解氧的影响诱导时机的影响基因工程菌的培养工艺培养基碳源氮源无机盐，微量元素，维生素，生物素一、培养基的影响一、培养基的影响 培养基的组成即要提高工程培养基的组成即要提高工程菌的生长速率，又要保持重组菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能质粒的稳定性，使外源基因能够高的表达。够高的表达。基因工程菌的培养工艺碳源常用的有葡萄糖 甘油 甘露糖 果糖等使用不同的碳源对

2、菌体生长和外源基因的表达有较大的影响。比生长率和呼吸强度相差不大 甘油：以甘油为碳源菌体得率较大。 葡萄糖：以葡萄糖为碳源产生的副产物较多。 用甘露聚糖做碳源，不产生乙酸，但比生长率生长强度较小。 葡萄糖对lac启动子有抑制作用，因此控制培养液中葡糖糖的浓度保持在低水平可减弱或消弱葡糖糖的阻遏作用。 lac启动子对使用乳糖做碳源较为有利，同乳糖还起诱导作用。 另外，培养基中的色氨酸对trp启动子控制的基因表达也有影响。lac启动子trp启动子基因工程菌的培养工艺氮源：各种有机氮源中酪蛋白水解物更有利于产物的合成与分泌。无机磷：在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，如在DNA、RNA、蛋白质

3、的合成，糖代谢、细胞呼吸及ATP水平的控制中过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。由于启动子只有在低磷酸盐的情况下才被启动，因此必须控制磷酸盐的浓度，使细菌在生长到一定密度时，磷酸盐被消耗至低浓度，目的蛋白才被表达。（起始磷酸盐浓度应控制在0.015mol/L左右，浓度低影响细菌生长，反之则目的蛋白不表达。）基因工程菌的培养工艺二、接种量的影响接种量：是指移入的种子液体积和培养液体积的比例，它的大小影响发酵的产量和发酵周期，其大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。 接种量小，菌体延迟期较长不利于，外源基因的表达。 采用大接种量，由于种子液中含有大量体外水解酶，有利于对基质的利用

4、可以缩短生长延迟期，使培养菌能迅速占领整个整个培养环境，减少污染机会（接种量过高往往会使菌体生长过快代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。结果表明：10%、15%的接种量延迟期极短菌群迅速繁衍，很快进入生长对数期，适于表达外源产物。）基因工程菌的培养工艺4.溶解氧（1）溶解氧的影响 外源基因的高水平表达的细胞需要大量能量，因此溶氧浓度对菌体生长和目标产物生成影响很大，菌群大量扩增耗氧进行代谢，饱和氧的供给十分重要。 饱和氧是指当水体与大气中氧交换处于平衡时,水中溶解氧的浓度。 发酵时，DO2下降，细胞生长减慢，ST值下降（发酵后期下降幅度更大）。研究表明， DO2值维持在较高水平（40%

5、）才有利于目标产物的获得， DO2 最低不得低于25%（2）改善氧供给量的方法：调整搅拌转速基因工程菌的培养工艺 常压时：搅拌转速不变，通气速度越大，对氧溶解度提高越小。甚至能回产生泡沫使罐利用率下降。 因此发酵前期，采用较低转速即可；发酵后期，采用较高转速。 优点：既可以满足工程菌生长，获得高活菌数，又可以避免发酵培养全过程采用高转速，节约能源基因工程菌的培养工艺诱导时机与表达程序基因工程菌的培养工艺6.诱导表达程序的影响 对于PL或PR启动型的工程菌来说，热诱导的程序对提高外源蛋白表达量是至关重要的。细胞生长的温度突然升高10度以上，其细胞内就会生成某些热激蛋白，以适应变化的环境。几乎各类

6、细胞遇到热诱导都会产生热激蛋白，在E.coli中约产生17种热激蛋白，如果增高的温度幅度不大，热激蛋白合成的速度很快又下降，恢复正常蛋白的合成。发酵罐夹层中通热蒸汽迅速升温2min中内完成诱导表达的升温过程 PS: 如果升温时间过长，则热激蛋白合成量剧增，外源蛋白相对含量降低，给后续的纯化精制造成困难。基因工程菌的培养工艺7.PH的影响发酵过程中，PH的变化是由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。细胞自身对PH具有一定调节能力，但当外界条件变化过于激烈，细胞失去自身调节能力，从而影响细胞正常生长。细胞生长期的最佳PH范围为6.87.4，而外源蛋白表达的最佳PH为6.06.5，因此，发酵

7、前期，PH控制在7.0左右，开始热诱导表达时，关闭碱泵，PH逐渐下降，当PH降至6.0时，重新启动碱泵，避免了环境激烈变化对细胞的不利影响。基因工程菌的培养工艺PH的影响必须建立工程菌发酵的最佳优化工艺：最快周期、最高产量、最好质量、最低消化、最大安全性、最周全的废物处理效果与最低失败率等综合指标。工艺最佳化需对不同的菌种做大量实验，取得重复性好的准确数据后，模拟发酵曲线，预测放大值，只有对菌种生物特性和发酵工艺了如指掌，最佳工艺条件设计才更合理。基因工程菌的培养设备生物药品已经进入生物技术时代，人们更多的应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。 基因工程菌发酵是为了获得最大量的基因表达产物，由于这类物质相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质，因此，培养设备以及控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因产