肝胆排泄转运体讲诉PPT课件

1、药物排泄途径转运体的分类肝脏药物转运体研究药物转运体的常用方法文献研究目目 录录第1页/共32页（一）药物排泄途径（一）药物排泄途径排泄途径排泄物收集法肾 脏大鼠代谢笼法、导尿管法、膀胱造瘘法、输尿管法胆 汁胆总管插入法乳 汁乳头按摩收集唾 液腮腺与颌下腺插管收集呼 气密封代谢笼吸收剂收集汗 腺第2页/共32页（二）转运体的分类（二）转运体的分类第3页/共32页第4页/共32页转运体转运物质典型底物血管侧膜Na+ -牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)胆汁酸；胆盐；胆汁酸类似物雌酮-3-硫酸有机阴离子转运蛋白（OATs）阴离子化合物、中性类固醇、生理物质(如前列腺素类和甲状腺激素)和某些B类疏水性阳

2、离子前列腺素E2,5-氟尿嘧啶、紫杉酚、茶碱有机阴离子转运多肽（OATPs）雌二醇-17-葡糖醛酸、雌酮-3-硫酸、罗舒伐他汀、非索非那定、替米沙坦有机阳离子转运蛋白（OCTs）有机阳离子药物及内源性物质(胆碱、胍等)扑热息痛葡萄糖醛酸苷、MPP+、四乙胺、胍丁胺（三）肝脏药物转运体（三）肝脏药物转运体第5页/共32页转运体转运物质典型底物胆管侧膜P-糖蛋白(P-gp)脂溶性较高的阳性或中性药物多柔比星、 长春新碱、红霉素、塞利洛尔、地西泮等多药耐药相关蛋白2(MRP2 )阴离子化合物及共轭代谢物普伐他汀、替莫普利拉、甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂胆酸盐外排转运蛋白（BSEP）未共扼结合的胆酸盐牛磺

3、胆酸盐、甘氨胆酸盐、胆酸盐、牛磺石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、牛熊去氧胆酸盐和他莫昔芬 乳腺癌耐药蛋白（BCRP）某些药物的胆汁排泄多种抗癌药如甲基蝶呤、多柔比星等（三）肝脏药物转运体（三）肝脏药物转运体第6页/共32页一、体内试验 基因缺陷动物模型先天遗传性基因缺陷模型基因敲除模型二、体内/体外试验 肝脏灌流技术离体肝脏灌流在体肝脏灌流（四）研究肝脏药物转运体的常用方法（四）研究肝脏药物转运体的常用方法第7页/共32页三、体外试验非洲爪蟾卵母细胞：cRNA注射单转染细胞：HEK293双转染细胞：Hela、MDCK-、LLC-PK1CMVs（微管膜囊泡）实验四、RT-PCR技术半定

4、量测蛋白表达 Western Blot技术定量测蛋白表达 （四）研究肝脏药物转运体的常用方法（四）研究肝脏药物转运体的常用方法第8页/共32页（五）文献研究（五）文献研究头孢妥仑（CDRT）胆汁排泄的分子机制及其对肝脏转运蛋白调节作用的研究第9页/共32页一、实验目的一、实验目的头孢妥仑转运体(Mrp2、Bcrp或P-gp)？转运 头孢妥仑？影响(Mrp2、Bcrp或P-gp)蛋白表达第10页/共32页在体肝灌流CDRT+抑制剂CDRT出口灌流液胆汁肝摄取率胆汁累积排泄率抑制剂是否影响肝摄取？转运体参与胆汁排泄大鼠口服不同浓度CDRT一周肝组织总RNART-PCR各转运体mRNA表达情况膜蛋白

5、Western Blot证实转运蛋白表达情况HPLC二、实验思路二、实验思路第11页/共32页三、实验材料三、实验材料实验动物Wistar大鼠，雄性，体重230250g主要试剂头孢妥仑标准品等主要仪器肝灌流仪，HPLC等第12页/共32页肝脏的血液供应非常丰富，接受两种来源的血供。（1）门静脉。主要接受来自胃肠和脾脏的血液；（2）腹腔动脉的分支肝动脉。门静脉与肝动脉进入肝脏后，反复分支，在肝小叶周围形成小叶间动脉和小叶间静脉进入肝血窦中，再经中央静脉注入肝静脉。四、实验方法四、实验方法1.肝灌流实验肝灌流实验第13页/共32页肝灌流装置肝灌流装置=灌流系统灌流系统+ 恒温系统恒温系统+气体交换

6、系统气体交换系统第14页/共32页1.1.实验相关溶液的配制 (1)抗凝缓冲液的配制 枸橼酸三钠 15.6g 枸椽酸 5.7g ddH2O 600m1(2)磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 NaCl(58.44) 8.0g KCl(74.55) 0.2g Na2HPO4.12H2O(358.14) 2.9g KH2PO4(136.09) 加dd H2O 1000ml 调pH 7.4 with HCl第15页/共32页(3)灌流缓冲液的配制NaCl(58.44) 118mM 6.9gKCl(74.55) 4.7 mM 0.35gMgSO4.7H2O(246.27) 1.2 mM 0.30gKH2PO

7、4(136.09) 1.2 mM 0.16gNaHCO3(84.01) 25 mM 2.10gGlu(198.17) 5 mM 0.96gCaCl2(110.99) 2.5 mM 0.28g加ddH2O 1000m1调pH 7.4 with NaOH第16页/共32页1.2灌流所需的牛血红细胞制备 (1) 3 L新鲜牛血与600m1抗凝缓冲液混匀，过滤，三层纱布置于大漏斗中。使牛血贴壁流下，以免红细胞因机械外力被破碎; (2)离心,5000rpm, l0min, 4 ，将上层的血浆、血小板和白细胞弃去，下层为牛血红细胞; (3)加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),混匀，离心，3000rpm,

8、l0min,4 ，清洗红细胞，弃上清; (4)重复步骤(3)3次，收集下层干净的牛血红细胞，4保存，备灌流时使用。第17页/共32页1.3.原位肝灌流法 (1)灌流室预热，使温度达37;将牛血红细胞与灌流缓冲液混匀，使红细胞的终浓度为20%，作为灌流液。设立对照组(头孢妥仑(1 uM)和实验组(头孢妥仑(1 uM)和不同转运蛋白的特异性抑制剂(20 uM)，具体研究如下。把灌流缓冲液和含药的灌流液放入水浴锅中加热至37 ，同时供氧;第18页/共32页第19页/共32页 (2) Wistar雄性大鼠于实验前夜禁食(不禁水)，乌拉坦麻醉，腹部U型开口，将内脏移至右侧，剥离并充分暴露门静脉、下腔静脉

9、、右肾动静脉和胆管; (3)胆管插管，固定，此时可见胆汁缓慢流出; (4)门静脉插管，固定，用预热的灌流缓冲液灌流肝脏，流速为12m1/min; (5)迅速剪断下腔静脉腹腔段，冲去肝脏内原有的血液，结扎右肾动静脉;第20页/共32页 (6)迅速打开胸腔，右心耳插管，使液体缓慢流出; (7)肝脏平衡l0min后，实验组用含抑制剂(20 uM)的灌流液灌流5min，再换含头孢妥仑(1 uM)和抑制剂(20 uM)的灌流液灌流;对照组用含等体积的抑制剂溶剂的灌流液灌流5min，再换含头孢妥仑(1uM)和等体积的抑制剂溶剂的灌流液灌流肝脏; (8)于0.5、1、3、 10、15、20、25、30min

10、收集出口灌流液; (9)于5, 15, 25min收集胆汁样品; (10)高效液相色谱法测定头孢妥仑含量，考察肝摄取率和胆汁累积排泄率的差别。肝脏摄取率 EH=1-Cin/Cout 胆汁中药物浓度胆汁体积 灌流液中药物浓度灌流速度灌流时间胆汁累积排泄率= 第21页/共32页1.4.高效液相色谱法测定样品中头孢妥仑的含量(1)色谱条件 色谱柱:Capcell pak C18 UG120 4.6X250mm(日本资生堂); 流动相:0.1%醋酸铵:甲醇(65: 35); 流速:0.8 ml/min; 检测波长:295nm; 进样器温度:4; 进样体积:25 ul第22页/共32页 (2)出口灌流液

11、样品预处理 离心，3000 rpm, 5 min, 4 ，取上清液90 ul置新的Ep管，加内标(25 ug/ml)10 ul,混匀，再加入甲醇200 u1,混匀，离心12000 rpm,15 min,4 。取上清液100 u1进样; (3)胆汁样品预处理 取胆汁样品10 ul，加30 u1 ddHzO，内标l0 ul,混匀，加50 u1甲醇，混匀，离心，12000rpm, 15 min, 4 。取上清液70 u1进样。第23页/共32页2.头孢妥仑对肝脏Mrp2,Bcrp,P-gp,Oct1和Oat2 mRNA表达的影响RT-PCR3.证实头孢妥仑对肝脏Mrp2蛋白表达情况Western Blot五、实验结果五、实验结果1.肝灌流实验1.1肝摄取率肝摄取率 加入抑制剂不影响CDRT的肝摄取第24页/共32页第25页/共32页1.2胆汁累积排泄率胆汁累积排泄率 Mrp2和Bcrp参与CDRT胆汁排泄 P-gp不参与第26页/共32页2.RT-PCR Mrp2、Bcrp和Oat2的mRNA上调 P-gp和Oct1的mRNA下调第27页/共32页3. Western Blot CDRT对Mrp2蛋白表达的影响有剂量依赖性第28页/共32页谢 谢 大 家！2014年4月第29页/共32页人有了知识，就会具备各种分