污染土壤中重金属Cr吸附菌株的筛选与鉴定

1、污染土壤中重金属c吸附菌株的筛选与鉴摘要：以cr污染土壤为菌源样品，富集培养与菌株 分离后，采用二苯碳酰二脐分光光度法从中筛选cr吸附株,共筛选分离出4株高效吸附重金属cr的细 < 一 i豈株。通过形态观察、生理生化试验对4株菌株进行了种属鉴定，初 步鉴定4株菌株均为芽翘杆菌(bacillus )关键词：土壤污染；重金属cr ;吸附;鉴定中图分类号:x53文献标识码:a文章编号:0439-8114(2016 ) 09-2218-04随着社会经济和工农业的发展，中国甚至全球许多国家 面临严重的cr污染威胁，土壤cr污染已成为人们普遍关注 的环境污染问题之一。cr盐、皮革、印染、电镀等涉cr

2、工 业的发展以及城市污水的非达标排放对农业土壤已造成一 定的毒害，其危害由于生物放大作用也逐渐威胁人类健康。 因此，cr被列为中国农田土壤环境质量评价的8个重金属控 制指标之一土壤中的cr最初来源于岩石风化，在自然条件作用下转 移到成土母质及土壤中：其次，随着城市化的推进。城市污水灌溉、污泥及城市垃圾正在成为土壤cr的另一个主要来 源；另外，随着冶金、制革、电镀等涉及cr污染工业的发 展，某些工厂和cr污染源所产生的含cr粉尘、cr渣及被 cr污染的地下水也能通过各种途径进入土壤造成cr的累积。通常，低浓度的cr对多种农作物的生长有刺激作用, 但是高浓度的cr则会危害农作物。另一方面人类食用c

3、r含 量超标的粮食、蔬菜后，进入人体，很可能会诱发多种慢性 疾病的发作cr污染土壤的治理途径主要有两种：一是改变cr在土壤中的存在形态，将c6+还原成cr3+ ,降低其在环境中的 迁移能力和生物可利用性：二是将cr从被污染土壤中清除。 根据以上两种思路发展出生物修复、工程修复、加入改良剂 及农业措施等治理方法，但是生物修复技术中利用微生物处 理污染土壤中重金属cr是目前实践证明最有发展前途的一 种新的重金属污染处理方法，与传统的处理方法相比，其具 有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低等优点， 在治理土壤重金属污染中有着很大的应用前景，具有很高的 研究价值。本研究目的是从污染土壤中筛选、

4、分离高效吸附 重金属cr的细菌菌株。并且对吸附能力较高的菌株进行种 属鉴定，以期为生物技术治理土壤cr污染提供菌种资源, 并为其进一步研究奠定科学基础1材料与方法 1.1菌源样品污染土样：采用五点法，取污水处理厂周边（表1）的土 壤样品混合。铲去表面土层。取5-1 ocm深处的土壤，装入无菌袋，记录取样地点、时间等，带回实验室，49冰箱保 藏备用1.2培养基1.2.1用于菌株的分离及保存；nb培养基：用于菌株液体培养及 种子制备。富集培养基。含100. 300、500mg/lcr6+的 液体培养基，用于重金属cr吸附菌株的富集培养。初筛 培养基-分离培养基。na培养基基础上添加终浓度为500m

5、g/l的cr6+ ,用于菌株分离、驯i化1.2.2复筛培养基nb培养基，用于菌株培养获得菌泥，以测定菌株对cr的吸附能力1.2.3菌种鉴定培养基根据常见细菌系统学鉴定手册配制1.3试验方法i>z<1.3.1 cr吸附菌株的分离筛选-菌株的富集、分离及纯培养 取5.0g 土样于含100mg/lcr6+的液体富集培养基中摇 床培养3d ,转接3次，富集培养液的cr6+浓度以200mg/lei£3递增，直到cr6+浓度达到500mg/lo将驯化后的菌株培养 液涂布于含500mg/l cr6+的na培养基中，379培养。将 苗落生长特征不同的菌株挑取到na斜面上培养，379培养

6、至菌苔长满，置于49冰箱备用，用于进一步地筛选、鉴定1.3.2 cr6+标准曲线的绘制 向一系列50ml比色管中分别加入 0、0.20、0.50. 1.00. 2.00. 4.00、6.00. 8.00 和10.0ml c6+标准溶液，用水稀释至标线。向比色管中加入 2ml显色剂。摇匀，放置10min ,在540nm波长下，以去 离子水作为参照。测量吸光度。绘制cr6+含量对吸光度的标 准曲线1.3.3菌株复筛-菌株吸附cr6+能力测定制备初筛菌株的菌泥备用。三角瓶中装入浓度为1000|jg/l的cr6+标准 液，接入菌泥，充分振荡摇匀后摇床培养，以不接菌泥作为 对照。每1h取样1次，以500

7、0r/min离心10min ,采用二苯碳酰二脐显色一紫外分光光度法测定上清液中cr6+的浓ei£3度，以此确定各菌种对cr6+的吸附情况。每个样品3次重 复。按以下公式计算菌体对cr6+的吸附率（q ）:q :（ co-ct） /c0x100%o式中，c为重金属离子初始浓度（mg/l ）, ct 为重金属离子平衡浓度（mg/l ）,挑选出吸附效果最好的菌 种，用于菌株种属鉴定1.4菌株种属鉴定ei£3首先进行菌落形态观察，将所得菌株划线接种于固体平板上,379培养24h ,观察单菌落形态。然后进行革兰氏染色试验，最后进行生理生化试验，根据常见细菌系统学鉴定 手册进行2结果与

8、分析 2.1 cr吸附菌株的富集与分离通过对菌液进行观察发现，随着cr6+浓度的增加，菌落的数量明显减少。06+浓度为500mg/l时，选择合适稀释浓度涂布的培养基平板，对生长较好的细菌进行分离纯化,得到18株形态各异的cr吸附细编号为a仁a2 b-1.b2、c-1. cx-9-k cx-9-2. d-1. e-1. e-2. f-k g-1.l-k k-1. m-1. n-1. 0-1，将所筛选的菌株接种到na斜面培养基上备用。通过对18株菌株的菌落形态观察，初步判断为细菌菌落，圆形或近圆形、湿润不透明, 详细描述见表22.9菌株吸附cr6+能力测定cr6+浓度（x ）与吸光度（y ）的标准

9、曲线见图1 ,各菌 株对cr的吸附情况见表3。由表3可以看出，菌株对重金属 cr的吸附作用存在差异，按2h时的吸附能力排序为 h-1=m-1 >cx-9-1 >cx-9-2>e-1=g-1 >f-1 >n-1 >0-1 >a-1 >l- 1 >b-1 >k-1 >b-2>d-i>a-2>e-2>c-1 ,其中对重金属 cr 吸附 效果排前4位的4株菌株在处理2h时的吸附率分别达98.86%, 98.86%. 97.02%、96.73% ,说明这 4 株菌株具有较好的应用前景2.3 4株菌株的种属鉴定2.3

10、.1落特征cx-9-1菌落直径为1.0cm，呈圆形，白eic色,边缘不整齐，容易挑取，中间有隆起，菌落不透明，有 褶皱，表面干燥：cx92菌落直径为09cm，呈圆形，白色, 边缘整齐，不容易挑取，中间有隆起，菌落不透明，无褶皱,表面干燥；菌落直径为0.3cm ,呈圆形，微黄色，边缘不整齐，容易挑取，扁平,m-1菌落直径为0.2cm，呈不规则圆形，微黄色，边缘整齐，不容易挑取，中间有隆起，菌落不透明，无褶皱，表面湿润（表2 b根据以上形态特征初步判断4株菌株均为细菌 落,菌落形态见图22.3.2菌体形态特征供试菌株经革兰氏染色后在显微镜下观察，都为杆菌m-1革兰氏染色呈阳性（图3）2.3.3生理

11、生化试验结果生理生化试验包括v.p试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、接触酶试验、葡萄糖氧化 发酵试验、柠檬酸盐试验等18项，试验结果如表4所示, 根据试验结果与常见细菌系统鉴定手册作初步判断，判 定cx-9-1. cx-9-2. h-1. m-1四株菌株均为芽翘杆菌（bacillus ）结果为土壤cr污染的微生物治理提供了菌种 资源，并为其进一步深入研究奠定了科学基础微生物吸附法去除土壤中cr6+的研究较少。srivastavaan等研究表明，土壤中cr6+含量为250mg/kg、黑曲霉作为吸 附剂时，15d内cr6+的去除率为75%o万俊杰等利用微生 物代谢产生的y-聚谷氨酸絮凝剂对含cr

12、6+废水进行66+去 除处理，结果显示，ph为4 ,30ml30mg/l的废水中添加y- 聚谷氨酸1.5ml和1%caci22.4ml时，c6+的去除率可达 55%。盛姣等通过试验得出微生物发酵米糠对cr6+的最佳吸附条件为微生物发酵米糠浓度10g/l.温度609、ph2、cr6+ 质量浓度不超过40mg/l、吸附平衡时间40min时，吸附率 达95.7%o valerie等将含cr泥土与链霉菌在培养基中混合培养，发现当泥土中cr6+浓度为1800mg/kg时，经过30d 后，去除率达到100%o本研究中筛选出的4株菌株较上述 各研究中对cr的吸附率更高，应用前景更广，可以将这些 直株进行进一步试验研究，探讨温度、ph、初始cr浓度等 因素对其吸附cr的影响关于土壤cr污染的生物技术治理，国内外学者们已经进 行了大量相关研究，筛选出一些重金属cr吸附菌株，如硫 酸盐还原菌、芽翘杆菌属、埃希氏菌属、阴沟杆菌、大肠杆、假单胞菌属等。胡勇等从不同来源的样品中分离出吸附eidcr6+较强的菌株x07