第2讲植物组织培养

1、李金亭李金亭Tel:el:mail: LEmail: L河南师范大学生命科学学院河南师范大学生命科学学院本讲主本讲主要内容：要内容：一、一、植植物组织培养的理论基础物组织培养的理论基础二、二、植植物组织培养操作技物组织培养操作技术术1 1、植植物的无性繁殖：物的无性繁殖：不不经经过精、卵细过精、卵细胞的结胞的结合，而是通过母体的合，而是通过母体的部分部分组织或器官组织或器官来进来进行繁殖的方式行繁殖的方式。植物的全能性植物的全能性即即植植物物体的部分组织或器官具有发育成完整植体的部分组织或器官具有发育成完整植株的潜在能力，称之为植物的全能性。

2、株的潜在能力，称之为植物的全能性。2 2、植植物细胞的全能性物细胞的全能性植物细胞的全能性：植物细胞的全能性：19021902年由年由HaberlandtHaberlandt提出，每一个植物细胞具有该植物的全部提出，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，都有分化成一个完整植株的潜遗传信息，都有分化成一个完整植株的潜在能力。在能力。外植体：外植体：植物组织植物组织培养中用来进行无培养中用来进行无菌培养的离体材料，菌培养的离体材料，可以是器官、组织、可以是器官、组织、细胞和原生质体等细胞和原生质体等 叶片叶片茎段茎段种子种子茎尖茎尖 植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论是植物组织培是植物组织培养

3、的核心理论。离体细胞具有生命的养的核心理论。离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经合适的营养和环境条件，离体细胞经历历脱分脱分化化和和再分再分化化过过程，可形成程，可形成再再生生植株。植株。 3 3、植植物物细胞物细胞全能性的实现途径细胞物细胞全能性的实现途径细胞全能性细胞全能性脱分化脱分化个体再生个体再生再分化再分化细胞分裂细胞分裂 细细胞全能性的表达是通过细胞胞全能性的表达是通过细胞脱分化脱分化和和再分化再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是

4、细胞全能性表达的最终体现。达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。去分化去分化愈伤组织：愈伤组织： 注注意：意： 魔芋体细胞胚魔芋体细胞胚a a 并不是所有的细胞脱分化的并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成结果都必然形成愈伤组织愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化以有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而后直接形成胚性细胞，进而形成形成体细胞体细胞胚胚；b b 多数愈伤组织内的细胞并不多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间其状愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差异态存在一定的差异。NAA（愈伤组织一定量）愈伤组织一定量）A A：

5、NAA NAA 0 mg/L0 mg/L，芽，芽（多），（多），根（无）根（无） B B：NAA NAA 0.1 mg/L0.1 mg/L，芽，芽（多），（多），根（无根（无）C C：NAA NAA 5.0 mg/L5.0 mg/L，芽（少），根（多芽（少），根（多）A B CBA（愈伤组织一定量）愈伤组织一定量）A A：BA(0 mg/LBA(0 mg/L) ) ，芽（减少），根（增多，芽（减少），根（增多）B B：BA(0.1 mg/LBA(0.1 mg/L) )，芽，芽（增多），（增多），根根（减少）（减少）A B黑暗条件下培养地烟草愈伤组织黑暗条件下培养地烟草愈伤组织 胚状体（体细胞胚

6、）发生胚状体（体细胞胚）发生: :是由愈伤组织形成类似种子的胚是由愈伤组织形成类似种子的胚的结构，同时产生芽端和根端的的结构，同时产生芽端和根端的结构，称为结构，称为胚状体胚状体。胚状体经历与合子胚相似的发育过程，从球形胚、胚状体经历与合子胚相似的发育过程，从球形胚、心形胚、鱼雷胚到成熟胚。心形胚、鱼雷胚到成熟胚。愈伤组织分化出不定芽愈伤组织分化出不定芽1. 1.灭灭菌与消毒菌与消毒2.2.培培养基的组分与配制养基的组分与配制3.3.培培养材料的接种养材料的接种4.4.种质资源的离体保存种质资源的离体保存1. 1.灭灭菌与消菌与消毒毒 植物材料消毒：常用的消毒剂植物材料消毒：常用的消毒剂 玻璃

7、的器皿灭玻璃的器皿灭菌菌 接种工具的灭菌接种工具的灭菌 实验服、口罩、滤纸灭菌实验服、口罩、滤纸灭菌 接种室灭菌接种室灭菌 物体表面灭菌物体表面灭菌 培养室灭菌培养室灭菌l 药剂灭菌药剂灭菌： 不同材料不同材料，不同灭菌剂其使用浓不同灭菌剂其使用浓 度、度、时间与效果不同。时间与效果不同。l干热干热：160-180160-180,1.5-2.0h,1.5-2.0hl湿湿热热：101.3kpa,121101.3kpa,121, 20-40min, 20-40minl 接种接种前前酒酒精棉球擦试精棉球擦试，并在酒精灯火焰上，并在酒精灯火焰上灼烧灼烧灭菌灭菌。l 喷雾、涂抹杀菌喷雾、涂抹杀菌l 紫外

8、灯照射（紫外灯照射（20-30min20-30min）l 臭氧灭菌机：臭氧灭菌机：1-2h1-2hl 熏蒸灭菌：熏蒸灭菌：5-8ml/m5-8ml/m3 3甲醛甲醛+5g/ m+5g/ m3 3 高锰酸钾；冰高锰酸钾；冰醋酸；醋酸；1-3%1-3%高锰酸钾或高锰酸钾或3%3%来苏儿。来苏儿。 常用灭菌的方法：常用灭菌的方法：2.2.培养基的组分与配制培养基的组分与配制(P(P173173) ) 培养基种类培养基种类 固体培养基固体培养基 液液体培养基体培养基营养分布均匀，生营养分布均匀，生长整齐一致，但通长整齐一致，但通气性差气性差。通气性较好，便于操作，通气性较好，便于操作，但营养分布不均，

9、生长但营养分布不均，生长发育不整齐。发育不整齐。培培养养基基成成分分水水无机盐无机盐有机物有机物植物激素植物激素支持材料支持材料辅助性物质辅助性物质无机盐无机盐大量元素大量元素(0.5mmol/L) (0.5mmol/L) 微量元素微量元素( 0.5mmol/L) ( 0.5mmol/L) 元素名称元素名称添加形式添加形式元素名称元素名称添加形式添加形式NKNO3, NH4NO3FeFeNa2-EDTAPKH2PO4 , NaH2PO4BH3BO3KKCl , KNO3 MnMnSO4CaCaCl2 2H2OCuCuSO4MgMg2SO4 7H2OMoNa2MoO4 2H2OSMg2SO4 7

10、H2OClCaCl2 2H2O有有机机物物碳水化合物碳水化合物蔗糖蔗糖（葡萄糖、果糖）（葡萄糖、果糖）维生素维生素天然复合物天然复合物椰乳椰乳香蕉泥香蕉泥马铃薯马铃薯水解酪蛋白水解酪蛋白其它其它肌肌 醇醇（环已六醇）（环已六醇）氨基酸氨基酸维维生生素素硫胺素硫胺素吡哆醇吡哆醇烟烟 酸酸生物素生物素泛酸钙泛酸钙叶叶 酸酸浓度：浓度：0.10.11.0mg/L1.0mg/L作用：作用： 参与酶的形参与酶的形成成, ,参与植物蛋白质参与植物蛋白质, ,脂肪的代谢等重要脂肪的代谢等重要生命活动生命活动. .氨氨基基酸酸甘氨酸甘氨酸丝氨酸丝氨酸酪氨酸酪氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺天冬酰氨天冬酰氨水解酪蛋白水解酪

11、蛋白水解乳蛋白水解乳蛋白生长生长素类素类 种类：种类：IAAIAA、NAANAA、IBAIBA、2,42,4D D 作用：诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。作用：诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。 浓度：浓度：0.050.055mg/L5mg/L赤霉素类赤霉素类（GAGA） 种类：有种类：有2020多种，组培中用多种，组培中用GAGA3 3 作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。成后加入。细胞分裂细胞分裂素类素类 种类：种类：6 6BABA、KTKT、ZTZT等等。 作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖

12、。作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖。 浓度：浓度：0.050.0510 0mg/L10 0mg/L脱落酸脱落酸（ABAABA） 作用：作用：1 1）抑制蛋白质的合成；抑制蛋白质的合成；2 2）抵消和抑制生长素、细胞分裂）抵消和抑制生长素、细胞分裂素、素、GAGA的作用；的作用；3 3）诱导休眠、促进衰老与脱落。）诱导休眠、促进衰老与脱落。植物激素植物激素培培养基支养基支持材持材料：料：最常用的是最常用的是琼脂琼脂，浓度一般为浓度一般为1%1%左右。左右。辅助性物辅助性物质：质：抗生素抗生素 抗氧化物抗氧化物 活性炭活性炭 常用种类常用种类：青霉素：青霉素链霉素链霉素 庆大霉素等庆大霉素等 用量

13、：用量：5 520%20% 注意：注意：抗生素对组抗生素对组织生长有抑制作用，织生长有抑制作用，使用要慎使用要慎重重. .常用半胱氨酸（常用半胱氨酸（VCVC）（5050200mg/L200mg/L液洗液洗涤外植体伤口表面）涤外植体伤口表面）作用：作用：具吸附作用；茎尖初代培养可具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖；促进生根；防褐化；促进新梢增殖；促进生根；防止组培苗玻璃化，利于胚胎培养。防止组培苗玻璃化，利于胚胎培养。常用浓度：常用浓度：0.50.510g/L10g/L注意：注意：活性炭具副作用。活性炭具副作用。培养基的种类培养基的种类培养基的选择培养基的选择培养基的选择培养基的选

14、择生长素浓度生长素浓度（mg/Lmg/L）细胞分裂素浓度（细胞分裂素浓度（mg/Lmg/L）0.51.534.5012340.556781.091011122.013151516培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法 一般配成比所需浓度高一般配成比所需浓度高10-10010-100倍倍的的母液，用时可按比例稀释。母液，用时可按比例稀释。（3 3） 培养基的配制程序培养基的配制程序称琼脂和蔗糖称琼脂和蔗糖加热溶解加热溶解加加 水水定容定容加入一定量的各种贮备液加入一定量的各种贮备液调调pHpH分装分装灭菌灭菌3.3.培养材料的接种培养材料的接种取材取材灭菌灭菌把外植体接种把外植体接种在培养基中在培养基中污染的预防：严格进行无菌操作。污染的预防：严格进行无菌操作。极性对培养的影响极性对培养的影响4.4.种质资源的离体保存种质资源的离体保存材料材料的选的选取取预处预处理理超低超低温保温保存存解冻解冻和洗和洗涤涤再培再培养养材料材料的选的选取取预处预处理理超低超低温保温保存存解