雌激素肝损害

1、雌激素诱导miRNA-29表达在CCl4诱导大鼠肝损害中的保护作用背景：雌激素（estradiol，E2）缓解CCl4诱导肝纤维化的潜在机制仍不清楚。结果：miRNA-29在CCl4处理的雌雄大鼠中的表达存在差异。E2和表达miRNA-29a/b的腺病毒可以增加肝内miRNA-29a/b水平且缓解CCl4诱导肝纤维化。结论：E2通过诱导miRNA-29a/b抑制CCl4诱导肝损害。意义：了解miRNA-29对肝纤维化的作用/调控并提供新的治疗靶点。摘要：以前研究表明雌性动物比雄性动物更容易耐受CCl4诱导肝纤维化，E2可以抑制CCl4诱导的肝纤维化。然而，这种现象的潜在机制仍没有完全阐明。本研

2、究报道E2诱导miRNA-29表达对CCl4诱导肝损害的作用。在用CCl4处理的雌雄大鼠中，肝内miRNA-29表达存在差异。尤其在CCl4处理4周后的雄性而非雌性大鼠肝内miRNA-29a 和miRNA-29b表达明显下降。在雄性大鼠肝内miRNA-29a 和miRNA-29b表达下调与肝纤维化进展早期相关，结果显示相对于雌性大鼠，雄性大鼠的纤维化标志物表达增加。此外，在雌性大鼠E2比雄性大鼠一直保持更高水平。TGF-1在大鼠肝癌细胞IAR20和正常肝细胞中减少miRNA-29a/b表达。相反，E2通过抑制NF-B信号通路提高miRNA-29a/b表达，NF-B信号通路负性调控miRNA-2

3、9表达。进一步研究发现E2和静注表达miRNA-29的腺病毒可以显著增加miRNA-29a/b水平和缓解CCl4诱导肝损害大鼠的肝脏纤维化标志物表达。总之，E2通过诱导肝内miRNA-29抑制CCl4诱导肝损害。纤维化以过量沉积细胞外基质（ECM）为特征，尤其是胶原。肝纤维化是慢性肝病的一种常见结局，最终可能进展为肝硬化和肝衰竭。CCl4诱导肝纤维化与不同病因引起的人肝纤维化有一些共同特征；相应地， CCl4诱导肝纤维化已作为纤维化模型1-3。本课题目的是研究雌雄大鼠对CCl4的不同纤维化反映及E2抑制肝纤维化的潜在机制。以前研究已在动物中观察到对非酒精性纤维化诱导因素（如CCl4）表现出性别

4、差异4，雌性动物相对于雄性大鼠更耐受CCl4诱导肝纤维化。通过研究这些差异，数个研究已证实E2抑制CCl4诱导肝纤维化动物模型具有保护作用5-7。Yasuda等6报道E2降低I型和II型前胶原以及金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）mRNA水平。也有研究发现在卵巢切除后的雌性大鼠，用E2替代治疗抑制纤维化，而用E2特异性抗体或卵巢切除雌性大鼠中E2的保护作用消失，E2水平也明显下降。Liu等5报道17-E2缓解肝纤维化、改善肝功能（指标为ALT和AST）。Shimizu等8在大鼠肝星状细胞（HSC）中观察到E2抑制肝纤维化的保护作用可能与抑制HSC激活有关。虽然已知E2作为强大的内源性抗氧化剂

5、，通过抑制活性氧化剂或间接调控细胞因子和其他生长因子的合成和释放，达到抑制肝纤维化作用，但E2抑制肝纤维化的潜在机制仍没有完全阐明。微小RNA（miRNA）是长约22nt的非编码RNA，与细胞靶基因mRNA的3非编码区序列不完全互补配对调控转录后基因表达9-11。以前研究已表明miRNA在细胞各个过程中起作用，包括细胞增殖、分化和凋亡。大量研究报道miRNA异常表达会导致多种疾病的发生发展。许多报道表明miRNA在HSC激活过程中起着重要的作用。对激活型大鼠HSC中miRNA表达分析证实了miRNA表达上调或下调12。也有研究证实过表达的miR-16和miR-15通过下调线粒体相关抗凋亡蛋白B

6、cl-2，导致caspases3、8、9激活，从而抑制HSC增殖和诱导凋亡13。这些发现表明miRNA通过激活HSC在肝纤维化进展中起着重要的作用。miR-29家族（包括关键胶原调节分子miR-29a和miR-29b）也参与了组织纤维化14-16。在心肌梗死过程中，人和鼠的心脏边界miR-29a和miR-29b表达下调17。此外，miR-29作为一个主要调节分子参与了肺纤维化15。最近，Roderburg等16在分析了CCl4诱导肝纤维化大鼠模型的miRNA调节基因芯片后，发现在CCl4诱导及胆管结扎后大鼠的肝脏中miR-29家族中所有成员均下调；此外，在细胞水平上，在大鼠HSC中过表达miR

7、-29b引起胶原表达下调。在目前的研究中，我们发现了在E2抑制CCl4诱导大鼠肝纤维化中的保护作用与雌雄大鼠肝脏中miR-29不同表达水平之间存在相关的特点，并发现在经4周CCl4处理的雄性而非雌性小鼠的肝脏中miR-29（miR-29a和miR-29b）水平显著下降，在雄性大鼠肝脏中miR-29a和miR-29b下调与肝纤维化加速进展密切相关，相对于雌性大鼠，雄性大鼠的胶原、SMA和TGF-1表达增加明显。我们的结果也表明E2提高了培养的大鼠肝癌细胞IAR20中miR-29a/b表达水平，同时在雌性大鼠中E2一直较雄性大鼠保持了更高水平。进一步研究发现用E2处理和转染表达miR-29a/b重

8、组腺病毒提高miR-29a和miR-29b水平(Ad-miR-29a/b)显著降低了大鼠肝脏中I型胶原和SMA表达水平，支持E2诱导miR-29a/b对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用。1、实验过程1.1 动物模型 动物培养和实验程序完全符合美国国家健康协会关于实验动物使用的指导方针并得到南京大学医学动物保护委员会批准。本研究实用8周龄雌雄性Balb/c小鼠（购自中国南京大学实验动物中心）。50只雄性小鼠分成5组，10只/组。CCl4组：用橄榄油配成的100 mL/L CCl4腹腔注射，50µl/次，2次/周1；E2组：腹腔注射，1 mg/kg，2次/周，同时使用CCl4处理，方法

9、同上5, 18；Ad-对照组和Ad-miR-29a/b组：3×108/U腺病毒，尾静脉注射，2次/周，同时使用CCl4处理，方法同上19；对照组：腹腔注射橄榄油，2次/周。12只雌性小鼠分成对照组和CCl4组，6只/组，每组治疗同配对雄性小鼠处理。用CCl4处理4周或8周后杀死小鼠。肝组织用4%甲醛收集固定用作组织学检测或立即液氮冰冻和保持-80用作RNA分离。丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）用ALT、AST试剂盒检测;E2水平用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测。1.2细胞培养和激活 人胚胎肾细胞293 (HEK293)和鼠肝癌细胞系IAR20购自上海

10、细胞室。细胞用含10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养液于37，5恒温CO2培养箱中进行培养。用胶原酶灌注小鼠肝组织中分离肝细胞后培养在完全培养基中。IAR20细胞和分离小鼠肝细胞放在6孔板，当细胞长至约90%时，它们培养在无血清培养基中，加入10ng/mL重组人TGF-1或100nM E2培养48h20。1.3 重组腺病毒构建及细胞感染 表达miR-29a/b重组腺病毒由PCR检测（如图Fig 1）。所有miRNA前体系列扩增引物如下：miR-29a正链,5GACGGTACCTGGTGGAGAACAACTTCG3;miR-29a 负链, 5CAGAAGC

11、TTCATCAAACCTTCAATCCC3;miR-29b正链,5ACCAGATCTGCGTCACGGCTC AATGTC3; miR-29b 负链, 5AGGCTCGAGCAGGCTTGATGGAGTCTGCT3。片段克隆入载体Ad Track-巨细胞病毒(pAdTrack-CMV)21。表达miRNA的重组载体PCMV分为pCMV-miR-29a、pCMV-miR-29b、pCMV-control。插入序列均由核苷酸测序证实。过程22如下：重组载体与PmeI连接，经电穿孔共转导结合到腺病毒质粒pAdEasy-1，最后导入大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒由同源性重组合成；选择阳性株并扩增

12、以制备DNA抽提，然后用PacI消化DNA；腺病毒质粒(pAd-miR-29a, pAd-miR-29a,pAd-control) 与PacI连接，用酒精沉淀净化，然后转导入HEK293装入一25cm2培养瓶中。用20ul脂质体2000连接4µg质粒DNA并监测绿色荧光蛋白(GFP)表达23。在转染12天后，收集细胞并离心10min，500g/min。然后3或4个循环在干冰中冰冻和37°C融化以从细胞中释放出病毒，收集Ad-miR-29a、Ad-miR-29b、Ad-control ，然后扩增和用腺病毒-X病毒纯化试剂盒纯化，实时定量PCR检测miR-29a/b水平22。用

13、孔板形成实验检测HEK293细胞中腺病毒滴度。感染复数为总孔板形成单位与感染细胞总数比率19。纯化病毒滴度为3.0×108PFU/ml。正如附图Fig 1描述，纯化病毒成功感染细胞并表达miR-29a/b。所有病毒储存在-80°C。1.4 组织病理检查和免疫组化 形态学研究方法：肝组织保存在4%甲醛中，嵌入石蜡并切成5um厚切片。一些切片按说明书用天狼星红染色24, 25。肝纤维化组织学定量评估用NIH成像软件测天狼星红阳性面积26。其他组织切片用甲苯和酒精递减冲洗。用免疫组化检测SMA、I型胶原、TGF-1，简单地说，就是在37°C用山羊血清阻断后，然后在4&#

14、176;C用3种纤维化标志物蛋白抗体培育1夜，用PBS冲洗3次，然后在37°C用生物标记的抗兔二次抗体培育30min，再用3, 3'-二氨基苯胺-H2O2染色，在用苏木精复燃，最后在光镜下检测。1.5 寡核苷酸和转染 表达小鼠NF-B基因转录激活的pBD-NF-B购自试剂盒。抗iB或NF-B p65的siRNA单核苷酸链购自基因制药生物技术公司。转染前24h IAR20细胞密度为1×106。按说明书用脂质体2000把iB siRNA、NF-B p65 siRNA、negative control (NC siRNA) 转染如细胞。不管是否有E2，用24ug pBD-

15、NF-bhuo pCMV-control (control)/106细胞使NF-B过表达。在转染后48h收集总RNA和蛋白，以用于分析iB、NF-B p65 、miR-29a/b表达。1.6 定量实时PCR 用Trizol试剂盒从肝组织抽提总RNA（2ug），然后按照说明书用AMV逆转录试剂盒把RNA逆转录成20ul cDNA。在应用生物测序系统7300上用2ul cDNA样本经实时PCR检测。用于SMA、I型胶原、TGF-1 mRNA定量的正反引物序列如下：TGF-1正链, ATCCCGCCCACTTTCTAC;TGF-1负链,AGTTCAAT CCGCTGCTCG;-SMA 正链, TCG

16、GATACTTCACGTCAGGA;-SMA负链,GTCCCAGACATCGGGAGTAA;Col1a1正链,GCTCCTCTTAGGGGCCACT; Col1a1 负链, CCACGTCTCACCATTGGGG; -actin正链, GAGACCTTCAACACCCCAGC; -actin 负链, ATGTCACGCACGATTTCCC。反应条件：95°C 5 min 95°C 15s, 58°C 30s, 72°C for 30s， 40 循环。熔点曲线分析是90°C (TGF-1), 85°C (-SMA and Col1a1)

17、 or 88°C (-actin)。在用-actin标准化后，每个样本重复三次数据的平均值作为计算基因表达变化27, 28。miRNAs 和U6 snRNA引物序列如下：mmu-miR-29a, UAGCA CCAUCUGAAAUCGGUUA; mmu-miR-29b, UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU; U6 snRNA, TGCTAATCTTCTCTGTATCGT。U6 snRNA定量作为内对照。1.7 蛋白免疫杂交印迹法Western 用免疫印迹法检测细胞核和细胞质抽提物29。简单地说，细胞溶解物在冷放射免疫沉淀缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM E

18、DTA, 1% sodium dodecyl sulfate, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, protease inhibitors, 1% Nonidet P-40, pH 8.0)扩增，然后在10000g /min离心5min。收集上清液用于细胞质抽提，细胞核漂浮于30ul高渗抽提缓冲液，16000g/min离心10min，上清液用于细胞核抽提。用微BCA蛋白测定试剂盒检测细胞质和核溶解物中蛋白量。蛋白（40ug）在10%丙烯酰胺凝胶分离并电转移至氟乙稀膜。然后在TBST (TBS plus 0.1% Tween-20)中用5%非脂干奶封闭1h。用原始抗iB、 NF-B p

19、65、histone H1 或 GAPDH抗体检测，然后用HRP共轭二次抗体检测。1.8 统计学分析 定量RT-PCR重复三次，整个实验重复数次。三个或以上实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。2 结果2.1 CCl4诱导肝损伤雌雄大鼠情况和miRNA-29表达不同 为了比较CCl4诱导雌雄小鼠肝纤维化情况，本实验用50ul CCl4 (100 ml/L 橄榄油) 腹腔内注射到雌雄Balb/c小鼠，2次/w。如Figures 1A、1B所述，在CCl4处理4周后，大部分雄性小鼠均出现明显肝纤维化损

20、害，胶原纤维明显上调(Fig. 1A, arrow)。相反，雌鼠未出现明显损害。下一步我们检测了CCl4处理组和橄榄油对照组小鼠SMA (Fig. 1C)、I型胶原(Fig. 1D)、TGF-1(Fig. 1E)水平。与组织染色结果一致，结果表明肝纤维化只出现在雄性而非雌性小鼠，我们发现TGF-1在雌雄小鼠肝组织中均上调，SMA、I型胶原上调进出现在雄性而非雌雄小鼠。有趣的是，qRT-PCR检测小鼠肝组织中miRNA表达水平，发现miRNA-29a和miRNA-29b,据报道14, 16其靶基因为I型胶原，在CCl4处理4周后的雄性而非雌性小鼠肝组织中明显下调(Fig. 1, F and G)

21、。以上结果表明CCl4诱导雌雄小鼠肝损伤后miRNA-29表达水平不同。Fig1. CCl4诱导肝损伤雌雄大鼠反应和miRNA-29不同表达。A、 B：组织染色提示在CCl4处理的雄性而非雌性小鼠的早期阶段呈现肝纤维化；C-E：CCl4处理组和橄榄油对照组小鼠SMA (C)、I型胶原(D)、TGF-1(E)mRNA水平；F-G：CCl4处理组和橄榄油对照组小鼠miRNA-29a（F）和miRNA-29b(G)表达改变情况。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。2.2 E2处理的鼠肝癌细胞中mi

22、RNA-29表达上调 在CCl4处理4周后小鼠肝功能显示雌雄性小鼠对CCl4处理反应不同。如表1所述，相对于单用橄榄油组，CCl4处理雄性小鼠显示血清ALT、AST水平明显提高，分别为31.3 ± 6.90 IU/L、32.3 ± 2.07 IU/L, 208.76 ± 20.6 IU/L、207.9 ± 23.3 IU/L。相反，相对于单用橄榄油组，尽管CCl4处理雌性小鼠血清ALT、AST水平也增高，但明显低于雄性大鼠水平。亦如所期望的，检测E2水平显示雌性小鼠E2水平显著高于雄性，不计是否用CCl4或橄榄油处理(CCl4处理组小鼠雌性：雄性为149

23、.5 ± 23.7 pg/ml：40.1 ± 3.40 pg/ml; 橄榄油组小鼠雌性：雄性为132.2 ± 12.3 pg/ml：40.5 ± 7.65 pg/ml)。表1.在有否CCl4处理雌雄性小鼠早期阶段（4w）肝损害不同情况实验数据用means ±SEM表示。P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。 尤其在CCl4处理阶段雌性小鼠高水平E2与miRNA-29a/b相关性提示E2参与miRNA-29a/b表达。以前研究显示一些miRNA（如miR-181a、miR-26a）与E2有关30。相应地，我们检测了E

24、2是否调控miRNA-29。本实验，我们用E2或者TGF-1刺激鼠肝癌细胞IAR20。TGF-1作为阴性对照组，显示可以减少miRNA-29水平下降16。Fig.2A示相对于对照组，E2处理组提高增加miRNA-29a和miRNA-29b水平(倍数分别是20 和10, p < 0.01)。与之前研究相似，我们也观察发现TGF-1明显降低小鼠肝细胞的miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2B)。我们进一步研究E2和TGF-1调节原代培养正常鼠肝细胞miR-29作用(Fig. 2, C and D)。结果显示在正常鼠肝细胞中E2明显提高miR-29a 和miR-29b水平(Fig.

25、 2C)，而TGF-1下调miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2D)。Fig2.小鼠肝癌细胞IAR20 (A 、B) 和原代培养正常鼠肝细胞(C、D)受E2和TGF-1刺激后miR-29a 和miR-29b表达水平变化情况。A、C：E2刺激IAR20(A)和原代培养正常鼠肝细胞(C)后miR-29a 和miR-29b表达水平增高；B、D：TGF-1刺激IAR20(B)和原代培养正常鼠肝细胞(D)后miR-29a 和miR-29b表达水平下降。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。2

26、.3 E2通过阻断NF-B通路提高肝内miR-29a/b表达水平 E2在调控炎症反应中起着广泛的作用。已知与E2调控有关的转录因子如NF-B、STAT-131, 32。有趣的是，之前研究也报道NF-B可以负性调控miR-29a 和miR-29b表达33。为了解是否NF-B参与E2上调miR-29a 和miR-29b表达，我们检测了有无E2处理IAR20细胞核中NF-B p65水平。如Figure 3A所示E2明显减少细胞核标志蛋白NF-B p65水平，而组蛋白H1未受影响。相反，TGF-1现在增加IAR20细胞核中NF-B p65水平(Fig.3B)。 Fig3. E2抑制和TGF-1诱导IA

27、R20 细胞NF-B聚集。Western blot分析显示100nM E2 (A) 或10ng/mL TGF-1 (B)作用48h后细胞核抽提物检测NF-B p65 和组蛋白H1水平。用波段扫描软件分析Western blot图。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。下一步我们准备验证E2上调miR-29a/b中NF-B作用。如图4所示，我们试图了解提高或阻断NF-B活性后IAR20细胞中miR-29a 和miR-29b表达情况。当细胞转染iB（一种在细胞浆使NF-B成无活性复合物的抑制蛋白）

28、特异性siRNA ，iB的mRNA (Fig. 4A)和蛋白(Fig. 4B) 均减少34, 35，而NF-B p65水平明显增加(Fig.4C)。NF-B活性增加明显抑制miR-29a (Fig. 4D)和miR-29b (Fig. 4E)表达。相反，当通过在IAR20细胞中转染NF-B p65特异性siRNA直接阻断NF-B活性，发现细胞中总NF-B p65(Fig. 4F)和NF-B p65 (Fig. 4G)减少。然而，在NF-B p65 siRNA转染后降低了NF-B活性的细胞中miR-29a (Fig. 4H)和miR-29b (Fig. 4I)水平明显减少。Fig4. NF-B负

29、性调控miR-29a 和miR-29b表达。A：IAR20细胞转染阴性对照(NC) siRNA或iB siRNA 单核苷酸，转染48h后用qRT-PCR检测iB mRNA 水平；B：用免疫印迹法检测iB水平，GAPDH作为对照；C：Western blot检测核裂解液中NF-B p65 和组蛋白H1水平；D、E：用qRT-PCR检测检测miR-29a (D) and miR-29b (E) 水平；F、G：转染NC siRNA或NF-B p65 siRNA到IAR20细胞48h后细胞浆提取物（F）和核提取物（G）中NF-B p65、GAPDH 、组蛋白H1水平；H、I：转染NC siRNA或NF

30、-B p65 siRNA到IAR20细胞中miR-29a (H)和miR-29b (I)水平。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。相反，E2处理的IAR20细胞中NF-B、NF-B p65水平一直保持高水平(Fig. 5, A 、B)，而miR-29a 和miR-29b水平没有提高(Fig. 5, C、D)。以上结果表明E2通过阻断NF-B活性提高miR-29a 和miR-29b水平。Fig5. NF-B过表达阻断E2对IAR20细胞中miR-29表达。A：在有否E2作用下转染pBD-NF-

31、B到IAR20细胞48h， Western blot检测核裂解物中NF-B p65和组蛋白H1；B：A板中NF-B p65水平量；C、D：A板中IAR20细胞中 miR-29a (C)和miR-29b (D) 。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。2.4 通过静注Ad-miR-29a/b提高miR-29水平缓解CCl4诱导雄性鼠肝纤维化 E2和TGF-1对miR-29表达的相反作用，分别表达促进和抑制功能，对于CCl4诱导鼠肝纤维化，提示miR-29在调节肝纤维化中起着关键作用。因此，我们下

32、一步了解小鼠肝组织中miR-29能否阻止或缓解CCl4诱导鼠肝纤维化。本实验我们用腺病毒构建了表达miR-29a和miR-29b的载体(Ad-miR-29a/b) ，然后在CCl4处理2周后静注Ad-miR-29a/b如雄性小鼠体内36。2次/w静注Ad-miR-29a/b，连续注射6周19。如图6A所示，用CCl4+ Ad-miR-29a/b处理雄性小鼠肝组织中miR-29a和miR-29b水平明显高于单用CCl4处理或CCl4+对照腺病毒载体组。组织化学检测显示相对于腺病毒载体对照组，Ad-miR-29a/b处理可以明显缓解CCl4诱导肝损伤(Fig. 6, B、 C)。Fig6. 通过静

33、注Ad-miR-29a/b提高miR-29水平缓解CCl4诱导雄性鼠肝纤维化。A：在CCl4处理期在雄性小鼠静注Ad-miR-29a/b提高miR-29a和miR-29b水平；B、C：静注Ad-miR-29a/b保护肝组织。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。Ad-miR-29a/b抑制CCl4诱导鼠肝纤维化的效果可以用纤维化标志物，如TGF-1、-SMA 和I型胶原。如Figure 7A所示Ad-miR-29a/b减少CCl4诱导的-SMA 和I型胶原mRNA，但在Ad-对照载体为变化；免

34、疫组化结果证明(Fig. 7B) Ad-miR-29a/b减少CCl4诱导的-SMA 和I型胶原蛋白。Figure 7 Ad-miR-29a/b减少CCl4诱导鼠-SMA 和I型胶原水平。A：有否CCl4或Ad-miR-29 a/b处理的-SMA 和I型胶原、TGF-1 mRNA水平；B：免疫组化显示有否CCl4或Ad-miR-29 a/b处理的-SMA 和I型胶原、TGF-1蛋白水平。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。2.5 E2通过提高miR-29表达水平保护CCl4诱导鼠肝损伤既然E

35、2可以上调鼠肝细胞中miR-29表达，我们下一步了解E2保护CCl4诱导鼠肝纤维化是否通过上调miR-29。本实验采用腹腔内注射E2 (1 mg/kg)，2次/w5, 18。如图8A所示与培养细胞所得结果相一致，E2可以抑制CCl4诱导miR-29。鼠肝组织免疫组化(Fig. 8, B and C) 显示相对于对照组，E2可以缓解CCl4诱导肝纤维化组织。接下来我们我们检测了在有无E2处理鼠肝组织中-SMA 和I型胶原、TGF-1表达和定位。如Figure 8D所示，E2处理雄性小鼠后减少了肝组织中-SMA 和I型胶原mRNA水平。免疫组化结果(Fig. 2)显示E2可以明显抑制CCl4诱导-

36、SMA 和I型胶原蛋白水平。Figure 8. E2保护CCl4诱导鼠肝纤维化。A：E2上调肝组织中miR-29a和miR-29b水平；B、C：E2缓解CCl4诱导鼠肝纤维化；D：在有无E2及CCl4处理鼠肝组织中-SMA 和I型胶原、TGF-1 mRNA水平。三个实验数据用means ±SEM表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。在CCl4处理8周后肝功能分析进一步显示Ad-miR-29a/b和E2保护CCl4诱导鼠肝纤维化(Table 2)。本研究结果表明，在在CCl4处理8周后肝功能明显受损，ALT、AST水平分别从31

37、.74 ± 6.91 IU/L、32.08 ± 2.52 IU/L增高到408.76 ± 44.8 IU/L、407.9 ± 53.7 IU/L。相反，用CCl4和Ad-miR-29a/b或E2处理(135.6 ± 26.9 IU/L、188.3 ± 40.3 IU/L, Ad-miR-29a/b；186.7 ± 35.5 IU/L、200.95 ± 45.6 IU/L, for E2)小鼠ALT、AST明显低于单用CCl4处理组。表2.每组雄性小鼠8周时CCl4诱导肝损伤情况实验数据用means ±SE

38、M表示。用T检验或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有统计学意义。3 讨论肝纤维化是由一系列信号传导调节并引起ECM沉积的复杂过程37-39。资料表明一些慢性肝病进展在男女性别上存在差异40。慢性病毒性肝炎的主要并发症肝纤维化或肝硬化男性发病率明显多于女性37, 40。通常，男性进展为肝硬化比女性更普遍29, 41。相反，女性对酒精性肝损伤比男性更敏感42。虽然肝脏不是一个典型的性激素靶器官，却含有雌激素受体并受E2作用27, 28, 43。因此，性激素在肝纤维化发病中起作用44, 45。以前研究表明E2治疗可以抑制CCl4或二甲基亚硝胺诱导肝纤维化5, 6。但

39、是调控非酒精性纤维化性别差异的具体机制仍没有完全阐明。本研究结果表明E2提高miR-29表达水平，并作为E2抑制肝纤维化的保护作用的潜在机制。首先，CCl4诱导雌雄性小鼠肝纤维化存在差异。虽然CCl4长期诱导（8-10w）将导致雌雄性小鼠肝纤维化8-10，但相对于雄性小鼠，肝功能及免疫组化结果示CCl4诱导4w时雌性小鼠更容易耐受肝纤维化。第二，雌性小鼠的E2水平高于雄性小鼠，且用E2治疗雄性小鼠可以明显减少CCl4诱导肝纤维化。最后，E2刺激可以明显减少IAR20细胞中miR-29a 和miR-29b 表达水平。有趣的是，E2诱导miR-29a 和miR-29b 表达情况与TGF-1结果相反

40、，肝纤维化诱导因子TGF-1减少miR-29a 和miR-29b 表达。总之，本研究结果表明miR-29与E2抑制CCl4诱导鼠肝纤维化的保护作用之间相关。进一步研究发现E2提高miR-29表达可能是通过抑制NF-B信号通路。相反，TGF-1可以提高IAR20细胞核中NF-B p65蛋白量，E2可以明显减少细胞核中NF-B p65水平(Fig. 3)。NF-B与miR-29a/b之间的反比关系也证实之前报道的NF-B通路负性调控miR-29表达33。研究已发现在肝纤维化发病过程中，miR-29家族（主要是miR-29a 和miR-29b）的靶基因为ECM主要成分之一胶原14-16。许多细胞可以

41、合成胶原蛋白，但主要是间质细胞如成纤维细胞。随着组织损伤，持续激活成纤维细胞表型并抗凋亡，成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，最终发展成纤维化39。在细胞水平上，miR-29过表达可以减少HSC中胶原及阻断纤维化发展过程。我们研究结果miR-29可以抗鼠肝纤维化。在CCl4诱导早期阶段，雌性小鼠肝组织中miR-29a 和miR-29b水平高于雄性小鼠，这可能与雌性小鼠肝纤维化程度低于雄性小鼠有关。通过转染Ad-miR-29a/b直接提高小鼠肝组织中miR-29水平，可以明显缓解CCl4诱导肝纤维化。此外，本研究发现miR-29作为数个促纤维化或抗纤维化调节因子的一个常见下游靶标。亦如Fig2所示，E

42、2可以明显诱导小鼠肝细胞miR-29a 和miR-29b表达，而TGF-1降低miR-29a 和miR-29b水平。最近Roderburg等16表明在肝纤维化过程中，不同上游信号因子（TGF-1、LPS）可以减少miR-29表达水平，提示参与肝纤维化的炎症信号通路中调控网络下游比TGF-1/ miR-29/胶原通路更复杂。结果表明miR-29参与抑制CCl4诱导鼠肝纤维化的保护作用，提示miR-29作为肝纤维化动态过程的一个基本调节剂。Maillot等30研究表明E2信号诱导miRNA表达广泛改变，如miR-26a 、miR-181a，在E2相关功能上起着关键作用，也支持我们的发现miR-29

43、对E2敏感。然而，目前关于E2调控miRNA（包括miR-29）潜在机制仍不清楚及尚需进一步研究。 总之，应用CCl4诱导鼠肝纤维化模型，研究表明miR-29参与抑制CCl4诱导鼠肝纤维化的保护作用。通过E2或直接转染Ad-miR-29a/b提高鼠肝组织中miR-29表达可以显著缓解肝纤维化，减少血清ALT、AST水平、I型胶原和-SMA阳性区域。在肝纤维化中，肝细胞中E2诱导miR-29表达可以作为一种新的抗纤维化调节机制。参考文献1.Domenicali, M., et al., A novel model of CCl4-induced cirrhosis with ascites in

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