高产蛋白酶菌株的选育

1、课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法武汉轻工大学食品学院 王宏勋1、 课堂报告依据的知识背景1、 遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。

2、PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有

3、一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。3、基因和性状1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的

4、“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。 结构基因是为细胞结构、组成( 如细胞生化反应所需的酶 )及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。 调节基因：用于编码组成型调节蛋白的基因。 操纵基因：

5、是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。 蛋白的表达不仅受结构基因控制，同时也受调节基因和操纵基因的调控。生物体的遗传信息通过 “中心法则” ( 少数生物以“逆转录”方式 ) 来完成世代间的传递，从而保证世世代代性状的相似性。 3）基因突变 突变是生物的基本属性，在广义上，突变是指染色体数量、结构及组成等遗传物质发生多种变化，包括基因突变和染色体畸变。一个基因内部遗传结构或 DNA 序列的任何改变，而导致的遗传变化称为基因突变。其发生变化的范围很小，所以又称点突变。染色体的畸变是指由染色体的大段损伤引起的。包括大段染色体的缺失、重复、

6、倒位等。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源。连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。 （1）遗传信息的改变。不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型：同义突变；错义突变；无义突变；移码突变（2）表型变化。包括以下几种类型：营养缺陷型；抗性突变型。条件致死突变型。形态突变型。另外还有抗原突变型、产量突变型等。 （3）突变率和基因符号 每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。例如，突变率为 10-8 的，即指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。例如，一个含 10 8个细胞的

7、群体，当其分裂为2×10 8 个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是 10-8 。 常用的基因突变符号：每个基因座位用其英文单词的头3 个英文字母的小写来表示，如组氨酸：his；其座位上的不同基因突变则在 3 个英文小写字母后加一个大写字母表示，如 hisA、hisB 代表组氨酸的A 基因和B 基因；在 3 个字母的右上方可用不同符号表示微生物的突变型，如 his+ 、his- 分别表示组氨酸原养型和缺陷型，gal+、gal- 分别表示能发酵半乳糖和不能发酵半乳糖，strs、strr，分别表示对链霉素敏感和具抗性。 （4） 突变的特点 不对应性。指突变的性状与引起突变的原因间无直

8、接的对应关系。这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题。 自发性。各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素处理下自发地产生。 稀有性。自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在 10 -6 -10 -9 之间。 独立性。突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的突变型，而且还可发生其他任何性状的突变型。某一基因的突变，既不提高也不降低其他任何基因的突变率。 诱变性。通过诱变剂的作用，可以提高上述自发突变的几率，一般可提高 10-10 5 倍。不论是通过自发突变或诱发突变 ( 诱变 ) 所获得的突变株，其间并无本质上的差

9、别，这是因为，诱变剂仅起着提高诱变率的作用。 稳定性。由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。 、 可逆性。由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变实验证明，任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。 （5）诱变机制。自发突变的频率是很低的，许多理化学、物理和生物因子能提高其突变的频率。凡能提高突变率的任何理化因子，都可称为诱变剂。所谓诱变剂并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。主要包括碱基的置换、移码突变、染色体畸变等。4）DNA 损伤的修复 微生物能以多种方式去修复损伤

10、后的 DNA ，主要有以下两种： (1) 光复活作用。把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。光复活由 phr 基因编码的光解酶 PHr 进行。 PHr 在黑暗是专一性地识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶 -DNA 复合物，当给予光照时，酶利用光能（ PHr 本身无发色基团，与损伤的 DNA 结合后才能吸收光，起光解作用）将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。 (2) 暗修复作用，又称切除修复。该修复系统除了碱基错误配对和单核苷酸插入不能修

11、复外，几乎所有其他 DNA 损伤均可修复，是细胞内的主要修复系统，涉及到 UvrA 、 UvrB 、 UvrC 和 UvrD 四种蛋白质的联合作用。 另外还有重组修复、 SOS 修复等方式。4、突变与育种 1）自发突变与育种 （1）从生产中选育。在日常的大生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株。 （2）定向培育优良品种 是指在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良菌株的过程。由于自发突变的频率较低，变异

12、程度较轻微，故用此法育种十分缓慢。 2）诱变育种 诱变育种是通过人工方法处理微生物，使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株，作生产和研究之用。 （1）诱变育种一般性原则 挑选优良的出发菌株。出发菌株是指用于育种的起始菌株。有利性状：高产、生长速度快、营养要求粗放、产孢子早而多的菌株等。 选择简便有效的诱变剂。在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而化学诱变剂中

13、，以 NTG 最为有效。 处理单孢子（细胞）菌悬液。在诱变育种中，所处理的细胞必须是单孢子或单细胞悬液状态。其目的是：一方面分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。在某些微生物中，即使用这种单细胞悬液来处理，还是很容易出现不纯菌落，这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的原故。 选用最适剂量。各种诱变剂有不同的剂量表示方式。剂量一般指强度与作用时间的乘积。化学诱变剂常以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。 充分利用复合处理的协同效应。 设计或采用高效筛选方案或方法。 筛选方案：在实际工作中，一般认为应采用把筛选过程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量（

14、选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精确度）为主。 筛选方法：初筛可在平板上进行，也可在摇瓶中进行，两者各有利弊，复筛必须在摇瓶中进行，并作精确测定。5、基因重组 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新重组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本。因此比诱变育种前进了一大步。同时也可消除某一菌株长期诱变导致产量上升缓慢现象。因此它是一种重要的育种手段。 1）原核微生物的基因重组。主要包括转化、转导（普遍性转导、局限性转导）

15、、接合、原生质体融合。 2）真核微生物基因重组。在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。 6、基因工程 基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程是在 20 世纪 70 年代开始出现的，三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是： DNA 的特异切割、 DNA 的分子克隆和 DNA 的快速测序。这项技术使人类能定向改造基因，编码特定蛋白，从此人类获得了主动改造生命的能力。目前一些基因工程产品如人胰岛素、生长激素、干扰素

16、、 DNA 疫苗、工程植物等。基因工程巨大的经济潜力和开发前景将使其成为本世纪的一个宠大的产业。基因工程的基本操作： 目的基因获得。获得基因的方法有化学合成法、基因文库法（指某生物染色体基因组各 DNA 片段的克隆总体）和 cDNA 文库法（指某生物全部 mRNA 的 cDNA 克隆总体）。 载体的选择。载体在细胞中能进行独立自主地复制；必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源 DNA 的插入；载体必须具有可供选择的遗传标记。主要载体有：质粒载体、噬菌体、柯斯质粒载体、 M13 噬菌体载体、真核细胞的克隆载体、人工染色体等。 目的基因与载体DNA 的体外重组。通过限制性核酸内切酶的作用来进行

17、 重组载体引入受体细胞。通过转化、转染、转导、显微注射、电穿孔法等方式被导入细胞中去。 重组体克隆筛选。通过菌落特征或噬菌斑等方法 对克隆的基因进行鉴定或测序。遗传检测法、核酸杂交法、免疫化学法、物理检测法等 控制外源基因的表达。 得到基因产物或转基因动物、转基因植物。7、菌种的衰退、复壮和保藏 在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想菌株是一件艰苦的工作，而要保持菌种的遗传稳定性更是困难。菌种退化是一种潜在的威胁，因此引起人们的研究与重视。 1）菌种退化现象 菌种退化（ degeneration ）是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。造成菌种退化的原因主

18、要有自然突变和环境条件。环境条件对菌种退化的影响，如营养条件，有人把泡盛曲霉的生产种，在 3 种培养基上连续传代 10 次，发现不同培养基和传代次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量下降有不同影响，说明营养成分影响菌种退化的速度。环境温度也是重要的作用因素。例如，温度高，基因突变率也高，温度低则突变率也低，因比菌种保藏的重要措施就是低温。其他环境因子，如紫外线等诱变剂也可加速菌种退化。 2）衰退的防止。控制传代次数；创造良好的培养条件；利用不同类型的细胞进行接种；采用有效的菌种保藏方法。 3）退化菌种的复壮。因为在退化的菌种中仍有一些保持原有菌种特性的细胞，故有可能采取一些相应措施，使这些细胞生长、繁殖，

19、以更新退化的菌株，称之为菌种的复壮。常用方法是纯种分离；通过宿主体内生长进行；淘汰已衰退的个体。 4）菌种的保藏 经诱变筛选、分离纯化以及纯培养等一系列艰苦劳动得到的优良菌株，能使其稳定地保存、保持原有的特性、不死亡、不污染，这就是菌种保藏的任务。 (1) 原理 人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧 3 方面设计。 （2）常用方法 菌种的保藏方法多样，采取哪种方式，要根据保藏的时间、微生物种类、具备的条件等而定。几种常用的保藏方法主要有斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、冷冻干燥保藏法。 另外还有悬液保藏法、寄

20、主保藏法、液氮保藏法等。2、 撰写课堂报告的目的1、 了解微生物遗传变异和育种、菌种保藏的相关知识；2、 明晰利用遗传变异基本知识选择微生物菌株选育方法体系；3、学会获取高产微生物生产菌株的研究方法。3、 撰写课堂报告的思路 通过对微生物遗传变异及育种相关知识的学习，以高产蛋白酶微生物菌株选育为科学问题，分析可用于高产蛋白酶菌株筛选的不同方法的差异，根据高产蛋白酶菌株筛选的要求，选择可组合使用的筛选方法组合，构建高产蛋白酶微生物菌株选育的方法体系。4、 课堂报告的正文1、蛋白酶简介 蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂, 占酶制剂市场的65%以上，广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、

21、饲料、化学工业、废物处理等行业。按最适反应pH 分，蛋白酶可分为碱性，中性蛋白酶和酸性蛋白酶。碱性蛋白酶的最适反应pH 一般大于9.0，是当前市场上最为广泛使用的蛋白酶。微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为生物酶的重要来源。以碱性蛋白酶为例，其产生菌有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌和霉菌。我国用于工业化生产的蛋白酶菌种主要有：地衣芽孢杆菌2709、地衣芽孢杆菌C1213以及短小芽孢杆菌289和209。产碱性蛋白酶的放线菌较少，主要是链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)，产生的碱性蛋白酶耐高温，很适合于工业生产。近

22、二十年来， 研究人员对低温碱性蛋白酶的研究取得较大进展，研究发现，产低温碱性蛋白酶的微生物主要有假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、异单孢菌属、耶尔森氏菌属、希瓦氏菌属等。2、 蛋白酶合成中心法则中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充和发展。 3、蛋白酶高产菌株的选育方法分析与选择 以碱性蛋白酶菌株选育为例，分析选育方

23、法如下： （1）自然选育技术。自然选育利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。自然选育步骤：通过表现形态（菌落大小，生长速度，颜色，孢子形成）来淘汰不良菌株；通过目的代谢产量的考察。；进行遗传基因型纯度试验；传代稳定性试验（2）诱变筛选技术。利用物理、化学诱变剂单独或复合处理原始菌株。迄今仍是蛋白酶育种的有效方法之一。国内较为典型的有中国科学院微生物研究所那淑敏等人于1987年利用亚硝基胍和紫外线复合处理、获得了产酶活力比出发菌株提高了近20倍的变异株。薛林贵等通过紫外诱导的方法得到一株产酶为22080 U/

24、ml的突变体。梅承芳等人以分离自碱湖的产碱性蛋白酶菌VmetschnikoviiDL33为出发株，经紫外线、硫酸二乙酯多次复合诱变，获得一高产突变株VmetschnikoviiDL33-51，其产生的碱性蛋白酶活力是出发菌株的5.74倍，48h发酵液酶活由350 U/mL提高至2010 U/mL。（3）原生质体技术。新近发展起来的原生质体技术，对实现有效的遗传育种提供了很大的方便，通过诱变、融合原生质体或原生质体的诱变融合相结合来改变菌种的遗传特性。原生质体融合可使双亲遗传物质在融合子中发生随机的多种整合。从而导致杂合子集双亲性状于一体，通过定向筛选，有可能得到带目的性状的整合体，且性状因具备

25、传代的物质基础而得以稳定的遗传下去，经实践证明，这是一种有效的遗传育种技术。薛林贵等人对地衣芽孢杆菌53号菌株在原生质体形成最佳条件下进行原生质体制备并多次紫外线诱变终得一株稳定高产的碱性蛋白酶产生菌53-G38-6，酶活力比原始菌株提高了近20倍。（4）蛋白质工程技术。蛋白质工程是指通过天然蛋白质或蛋白质衍生物的结构分析，确定其三级结构模型，然后通过分子设计合成突变基因，经筛选突变体DNA，合成相应蛋白质的方法。其研究主要集中在提高碱性蛋白酶的稳定性，抗氧化性及改变蛋白酶的专一性等。我国在蛋白质工程技术选育高产碱性蛋白酶菌株取得了重大成就。王贤舜用蛋白质工程的方法在计算机图像系统上对预定的分

26、子改造方案进行了预测，成功地完成了构建1个分泌热稳定性比野生型枯草杆菌蛋白酶高4倍的工程菌。（5）基因工程技术。利用基因工程技术手段提高菌种的产酶能力， 不仅使菌种的产酶量有极大地提高， 而且能够改变酶的某些特性以求满足生产需求， 促进了理论研究与实践应用的紧密融合，大大缩短了从探索研究到生产应用的周期，同时也克服了传统菌种选育方法的随机性和盲目性，为微生物育种提供了一条新的思路和途径。王培之等成功利用遗传工程的方法构建一个分泌型高表达的枯草杆菌碱性蛋白酶E的枯草杆菌质粒宿主系统。刘永亮等利用枯草杆菌碱性蛋白酶E基因的信号顺序构建分泌表达载体获得成功。结合我们的研究实际，拟主要采用诱变筛选的方

27、法来进行高产蛋白酶菌株的选育研究。 4、 蛋白酶高产菌株的选育方法体系体系构建1） 高产原始菌株的获取 菌种分离的流程如下：标本采集 纯种分离菌种初筛菌种复筛菌种保藏 采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。菌株初筛：分别用无菌牙签将各株芽孢杆菌点种于酪素培养基平板中，每个菌株做3-4个重复，

28、置37培养24h 后，观察平板上菌落周围的透明圈大小，用10%HCl溶液淹没平板进行判断。测量菌落的直径和透明圈直径，取其平均值，计算出透明圈直径与菌落直径之比。比值越大，说明产蛋白酶能力越强。菌株复筛：挑选初筛中产蛋白酶能力较强的菌株，采用摇瓶培养小型发酵试验，测定蛋白酶分泌情况，蛋白酶分泌量越大，说明产蛋白酶能力越强。菌种保藏：采用斜面保藏法对菌株进行保藏。 2）紫外诱变紫外诱变致死率曲线的测定：取适量活化培养至对数期的高产原始菌株培养液离心去上清，菌体用无菌生理盐水和0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH5.8）各洗涤一次后，将打散的细胞悬浮于缓冲液中，紫外灯（照射距离30cm）预热30min后，进行不同时间（0s-240s）的紫外照射，每隔20s取样一次。将上述经诱变处理的菌悬液适当稀释后涂平板，同时以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照，将上述涂匀的平板，置37培养24h后的平板取出进行菌落计数，根据对照平板上菌落数，依据下列公式计算出每个处理的致死率，绘制致死率曲线。 诱变突变株筛选：根据致死率曲线，以致死率约为70%80%的诱变剂量处理菌悬液，紫外照射后的微生物细胞适当稀释后涂布于酪蛋白培养基，37培养24h，测量菌落的直径和透明圈直径，计算出透明圈直径与菌落直径之比，挑选产蛋白酶能力较强的菌株。遗传稳定性实验：将筛选到的菌株接种于筛选培