第1节植物组织培养技术

1、第第十八章十八章 细细 胞胞 工工 程程 目目 录录1 1 植物组织培养技术植物组织培养技术2 2 动物细胞培养技术动物细胞培养技术3 3 细胞培养应用细胞培养应用生物制药生物制药4 4 动植物新品种创建技术动植物新品种创建技术5 5 生物反应器与组织工程生物反应器与组织工程第第一节一节 植物组织培养技术植物组织培养技术植物人工繁殖的方法（组培）植物人工繁殖的方法（组培）外植体愈伤组织单细胞激素调控体细胞胚器官发生胚胎发育再生植株植物人工种子一、一、植物组织培植物组织培养概述养概述（一）定义（一）定义 植物器官、组织、细胞或原生质体等外植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在

2、人工培养基上，植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成在适当条件下诱发长成完整植株完整植株的一种技术。的一种技术。 （二）组织培养的分类（二）组织培养的分类v据外植体不同据外植体不同: :植株培养、器官培养、组织培植株培养、器官培养、组织培养（含愈伤组织）养（含愈伤组织）v据操作方法不同：据操作方法不同：固体培养、液体培养（包固体培养、液体培养（包括振荡培养、旋转培养、静止培养）括振荡培养、旋转培养、静止培养）（三）（三） 植物组织培养植物组织培养条件条件1.生物条件生物条件 外植体外植体（Explant）主要指用于离体培养的）主要指用于离体培养的植物或组织切段植物或组织切段

3、。 因素：因素： 不同植物品种不同植物品种 同一品种不同取材部位、发育阶段同一品种不同取材部位、发育阶段 一般：生长点、幼嫩组织一般：生长点、幼嫩组织2.2.物理条件物理条件： 培养培养环境、环境、组织培养室组织培养室无菌环境，人工控无菌环境，人工控制温度、光照、湿度等培养条件。制温度、光照、湿度等培养条件。 需要一定的设备、器材和用具。需要一定的设备、器材和用具。2.2.物理条件物理条件： 3.3.化学条件化学条件：培养基培养基（1 1）无机盐无机盐 培养基中无机盐的浓度通常在培养基中无机盐的浓度通常在25mM左左右。右。 根据添加量多少分为根据添加量多少分为大量元素大量元素（浓度大（浓度大

4、于于0.5mmol/L）和）和微量元素微量元素(浓度低于浓度低于0.5mmol/L)。3.3.化学条件化学条件：培养基培养基（1 1）无机盐无机盐大量元素大量元素：主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁。 氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核 酸和酶的主要成分酸和酶的主要成分。微量元素微量元素：主要包括铁、锰、铜、锌、氯主要包括铁、锰、铜、锌、氯、 硼、钼等。这些微量元素对于蛋白硼、钼等。这些微量元素对于蛋白 或酶的生物活性十分重要，并参与或酶的生物活性十分重要，并参与 生物过程的调节生物过程的调节。（2 2）有机物有机物 常用的有机物常用的有机物：糖

5、类、氨基酸、维生素糖类、氨基酸、维生素、肌醇、嘌呤类等。肌醇、嘌呤类等。糖类糖类：是离体培养的植物细胞所必需的，既是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为可以作为碳源碳源，又可以维持，又可以维持渗透压渗透压。 最常用的碳源是最常用的碳源是蔗糖蔗糖，葡萄糖和果糖也是，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在蔗糖使用浓度在2%2%3%3%。（2 2）有机物有机物氨基酸氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是吸收利用。培养基中

6、最常用的氨基酸是甘氨甘氨酸酸，其他的如，其他的如精氨酸精氨酸、谷氨酸谷氨酸，谷酰胺谷酰胺、天天冬氨酸冬氨酸、天冬酰胺天冬酰胺、丙氨酸丙氨酸等也常用。等也常用。 通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物混合物。 用量用量：10-1000mg10-1000mgL L维生素维生素：以各种辅酶形式参与多种代谢活动，以各种辅酶形式参与多种代谢活动， 对生长、分化等有好的促进作用。对生长、分化等有好的促进作用。0.1-1mg0.1-1mgL L 常用的维生素包括常用的维生素包括：盐酸盐酸硫胺素（硫胺素（V VB1B1）、

7、）、盐盐酸酸吡哆醇（吡哆醇（V VB6B6）、）、VcVc（抗坏血酸）、有时还使用（抗坏血酸）、有时还使用生物素生物素、叶酸叶酸、V VB12B12等。等。vV VB1B1对对愈伤组织的产生和生活力愈伤组织的产生和生活力有重要作用有重要作用；vV VB6B6能能促进根的生长促进根的生长；vVcVc有有防止组织变褐防止组织变褐的作用。的作用。肌醇肌醇：对对糖类的相互转化有促进作用糖类的相互转化有促进作用。能促进能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。成

8、也有作用。使用浓度一般为使用浓度一般为lOOmglOOmgL L。腺嘌呤腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体物质之一是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素能促进细胞合成分裂素，有利于细胞，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成的分裂和分化，促进芽的形成。（3 3）调节物质调节物质 植物激素植物激素(Phytohormone(Phytohormone) )：是植物自然状态是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。物。能影响生长和分化能影响生长和分化。 植物体内的激素与细胞内某种称为植物体内的激素与细胞内某种称为激素

9、受激素受体体的蛋白质结合后，的蛋白质结合后，影响影响DNADNA、RNARNA和蛋白质的和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。现出调节代谢的功能。生长生长素素(auxin(auxin) )： 是由色氨酸通过一系列中间产物形成的是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。生长素主要用来生长素主要用来刺激细胞分裂刺激细胞分裂和和诱导根的分化诱导根的分化 常用的生长素有：吲哚乙酸（常用的生长素有：吲哚乙酸（IAAIAA）、）、2,4-2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸( (2,4-D2,4-D) )、萘乙酸、萘乙酸( (NAANAA) )

10、、吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBAIBA）等。）等。 生长生长素素(auxin(auxin) )： IAAIAA活力较弱。活力较弱。 NAANAA和和IBAIBA广泛用于生根，并与细胞分裂素广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。互作促进芽的增殖和生长。 2,42,4D D促进愈伤组织的形成上活力最高，促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。但它强烈抑制芽的形成。细胞分裂素细胞分裂素 （CytokininCytokinin）: : 大多是大多是嘌呤族衍生物嘌呤族衍生物，根，根、茎端、萌发中、茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子都能合成分裂素。的种子、发育中的果实和种子都能合

11、成分裂素。 分裂素的生理作用分裂素的生理作用主要是主要是诱导芽的分化促诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。细胞分裂素细胞分裂素 （CytokininCytokinin）: : 包括激动素（包括激动素（KTKT）、）、6-6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（BABA）和玉米素（和玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是BABA。其中其中ZTZT活性最强，但昂贵，常用的是活性最强，但昂贵，常用的是BABA。激素配比激素配比 （ 生长素生长素/ / 细胞分裂素细胞分裂素） 高高：利于根的形成和愈伤组织的形成利于根的形成和愈伤组织的形成/ / 适

12、中适中：有利于根芽的分化有利于根芽的分化 低低：有利于芽的形成有利于芽的形成19561956年，米勒（年，米勒（MillerMiller）与斯库格（）与斯库格（SkoogSkoog）一起提出了一起提出了植物激素控制器官形成植物激素控制器官形成的观点的观点。（4 4）其他辅助成分）其他辅助成分v抗生素：抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素等，用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在量在5-20mg5-20mgL L之间。之间。v抗酚类氧化物：抗酚类氧化物：半胱氨酸、半胱氨酸、VcVc，可用，可用50-50-200mg200mgL L涂于外植体伤口表面。涂于外植体伤口表面。v活性炭，活性炭，0.5-10g

13、0.5-10gL L，吸附非极性物质和色，吸附非极性物质和色素等大分子物质。素等大分子物质。富盐平衡培养基富盐平衡培养基： 使用最广。代表使用最广。代表有有MSMS、LSLS、BLBL、BMBM、ERER等。等。 特点是特点是： 无机盐浓度高，无机盐浓度高，微量元素种类微量元素种类全；元素间比全；元素间比 例适当，离子平衡性好，例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能具有较强的缓冲能 力、稳定性好、营养丰富，力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需一般培养时无需 再加入有机成分。再加入有机成分。培养基培养基分类分类 高硝态氮培养基高硝态氮培养基：代表代表有有B5B5、N6N6、SHSH。 特点是：

14、特点是： 硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（高浓度的硫胺素（VB1VB1）。）。 低盐培养基低盐培养基: :代表代表 WhiteWhite、WSWS、HEHE、HBHB 特点是特点是： 无机盐、有机成分含量浓度低，多用作无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基生根培养的培养基。 中盐培养基中盐培养基：代表有代表有NitschNitsch、MillerMiller、H H、BlaydesBlaydes。大多是在。大多是在MSMS基础上改良设计基础上改良设计。 特点是：特点是：大量元素无机盐为大量元素无机盐为MSMS的一半，微的一半，微量

15、元素种类减少、含量增高。维生素种类比量元素种类减少、含量增高。维生素种类比MSMS增多，例如增加了生物素、叶酸等增多，例如增加了生物素、叶酸等。二、植物组织培养的技术路线二、植物组织培养的技术路线 （一）培养材料（全能细胞）采集（一）培养材料（全能细胞）采集 受精卵受精卵 分生组织细胞：分生组织细胞：如分生组织、根尖、嫩茎、如分生组织、根尖、嫩茎、幼叶、花等的细胞。幼叶、花等的细胞。 快速繁殖多用茎尖细胞；无病毒培养多仅取快速繁殖多用茎尖细胞；无病毒培养多仅取茎尖分生组织细胞茎尖分生组织细胞 配子和单倍体细胞配子和单倍体细胞（二）培养材料的消毒（二）培养材料的消毒v材料洗净、沥干、切成小块材料

16、洗净、沥干、切成小块 v70%70%酒精或酒精或-10-10H H2 2O O2 2浸泡浸泡30-60s30-60s（无菌）（无菌）v消毒消毒10min10min（饱和漂白粉液或（饱和漂白粉液或0.01%HgCl0.01%HgCl2 2） v无菌水冲洗干净无菌水冲洗干净(3-4(3-4次次) )（三）制备外植体（三）制备外植体v将消毒材料按培养要求进行处理（将消毒材料按培养要求进行处理（无菌无菌） 如：切成如：切成0.2-0.5cm0.2-0.5cm厚的小块厚的小块( (片片););去去除芽的鳞片、嫩枝的外皮、种皮胚乳等。除芽的鳞片、嫩枝的外皮、种皮胚乳等。但叶片不需剥皮但叶片不需剥皮 注意：

17、注意：整个过程无菌操作；严禁用手整个过程无菌操作；严禁用手触摸材料触摸材料 （四）接种与培养（四）接种与培养v接种：接种：外植体植入培养基上（外植体植入培养基上（4-104-10个个/ /瓶）瓶）v封口：封口：培养瓶、管等用无菌材料密封培养瓶、管等用无菌材料密封v愈伤组织培养：愈伤组织培养：外植体膨大形成愈伤组织外植体膨大形成愈伤组织v增殖：增殖：继代培养与分化培养。继代培养与分化培养。 25 25C C左右培养出新梢，分株或切段左右培养出新梢，分株或切段 后于增殖培养基上继续培养成芽苗后于增殖培养基上继续培养成芽苗植物组培流程植物组培流程无菌操作及操作车间无菌操作及操作车间植物组培室植物组培

18、室植物组织培养的应用：植物组织培养的应用： v（1 1）试管苗的快速繁殖）试管苗的快速繁殖v（2 2）无病毒植物的培育）无病毒植物的培育v（3 3）品种选育品种选育v（4 4）人工种子）人工种子v（5 5）转基因植物的培育）转基因植物的培育三、三、植物组织培养再生植株的途径植物组织培养再生植株的途径（一）器官发生途径（一）器官发生途径：成熟细胞成熟细胞愈伤组织愈伤组织 出根出芽出根出芽完整植株。完整植株。（二）体细胞胚发生途径（二）体细胞胚发生途径： 成熟细胞成熟细胞分生细胞分生细胞胚状体胚状体完整植株。完整植株。离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞或细胞 ( (外植体外植体) )愈

19、愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化愈伤组织愈伤组织：是植物细胞脱分化后形成和一种无：是植物细胞脱分化后形成和一种无 定形状态的薄壁细胞。定形状态的薄壁细胞。 愈伤组织愈伤组织具有再度分化成其他组织细胞的能力。具有再度分化成其他组织细胞的能力。铁皮石斛组培苗铁皮石斛组培苗炼苗与移栽炼苗与移栽炼苗炼苗: : 不打开瓶口强光炼苗不打开瓶口强光炼苗2-32-3天天; ;开口炼苗开口炼苗1-21-2天天. .移栽：移栽： 自来水洗净培养基（防菌），可再用自来水洗净培养基（防菌），可再用0.1%-0.1%-0.3%0.3%高锰酸钾或多菌灵浸泡高锰酸钾或多菌灵浸泡2020分钟；苗床上

20、插分钟；苗床上插孔置苗后孔置苗后加压加压苗床上基质（置苗前浇透水），苗床上基质（置苗前浇透水），移到高湿度环境（移到高湿度环境（90%90%）。）。苗苗 床床 三、人工种子三、人工种子（Artificial seed） 所所谓谓人工种子人工种子，就是将组织培养产，就是将组织培养产生的生的体体细胞胚或不定芽细胞胚或不定芽包裹在能提供养分的包裹在能提供养分的胶囊胶囊里里，再在胶囊外包上一层，再在胶囊外包上一层具有保护功能具有保护功能和防和防止止机械损伤的外膜机械损伤的外膜，造成一种类似于种，造成一种类似于种子的子的结结构。构。 （一）结构（一）结构 天然种子的结构：天然种子的结构： （一）结构（一

21、）结构 天然种子的结构：天然种子的结构： （一）结构（一）结构 从外向里包括三部分从外向里包括三部分： 1. 1.人工种皮人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；丧失和防止外部力量冲击； 2. 2.人工胚乳人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植，含有必需的营养成分和某些植物激素；物激素； 3. 3.胚状体或芽。胚状体或芽。胚状体胚状体人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳（二）人工种子的优点二）人工种子的优点v1.1.便于运输和储藏便于运输和储藏（相对于试管苗）（相对于试管苗）。v2.2.人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通人工胚乳可根据不同植物的要求配

22、制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子。成分，使人工种子优越于天然种子。 v3.3.可以固定杂种优势，加速良种繁育。可以固定杂种优势，加速良种繁育。v4.4.可作为植物基因工程和遗传工程的载体。可作为植物基因工程和遗传工程的载体。v5.5.可保存珍贵稀有植物品种。可保存珍贵稀有植物品种。（三）人工种子的制作（三）人工种子的制作 1. 1.胚状体同步发育胚状体同步发育v抑制剂法抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如制剂（如5-5-氨基尿嘧啶），一旦去除抑制剂氨基尿嘧啶），一旦去除抑制剂后

23、细胞可以同步发育。后细胞可以同步发育。v低温法低温法：低温处理抑制细胞分裂，再恢复正低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化常温度可以使细胞分裂同步化。（三）人工种子的制作（三）人工种子的制作 1. 1.胚状体同步发育胚状体同步发育v渗透压法渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育在某一阶段，然后再使其同步发育。v通气法通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入乙烯烯等）生成。可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂或氮气控制细胞同步分裂。（三）人工种子的制作（三）人工种子的制作 1. 1.