USP29(61)_微生物限度检查

1、<61 >微生物限度检查木章所提供的检测程序用于测定包括原料药及制剂在内的各种药品屮需氧菌数量以及 不含有指定的微生物。如果已有充分的证据证明某种自动化的方法可以给出与本章所提供 的方法等效的或更好的实验结果，可以用该方法替代本章所捉供的方法。在实验准备以及 实施的过程中，应遵守无菌操作。除另有规定外，本检杳法中“孵育”是指将容器置于温 度控制在30-35°c的空气中24-48小吋。术语“生长”在此处是专用于表示存活的微生物 的增殖。预试验(验证试验)应冇充分的证据证明在实验条件下检品本身对可能存在微生物的增殖无抑制作用，这 在很大程度上决定了下述所规定的检查方法的结果有

2、效性。因此，应进行预试验，测定金 黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌分别接种到稀释的检品中共同培 养后的存活情况，以使检查标准化并作为随后试验的具体要求。方法如下：接种1ml金黄 色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌的24小时肉汤培养物(稀释度大丁 等于10一3)至最低稀释级样品供试液中(样品用ph 7.2磷酸盐缓冲液，大豆酪蛋白水解物 琼脂培养基或乳糖液体培养基稀释)，若微牛物在相应的培养基屮不能牛长，则该部分试验 无效，有必要按下述步骤对实验进行调整：通过(1),增加稀释剂的体积，供试品量保持 不变，或(2)在稀释剂屮加入足够量的灭活剂；或(3)适当地将(1)和

3、(2)结合使接 种物可以生长。可在培养基中加入0.5%的人豆卵磷脂和4.0%的聚山梨酸酯20以中和供试品中的所存 在的抑菌成分。或者用酪蛋白水解物大豆卵磷脂聚山梨酸酯20培养基按前述方法重复试 验以确认对供试品中的保护剂或其他抗菌剂的中和作用。若产品中含有抑菌成分，而该产 品又是可溶的，可采用无菌检查项下产品的无菌检查法屮的薄膜过滤法。如杲在加入灭活剂或大大增加稀释剂的体积后仍不能使上述培养物恢复存活，而且该 产品不适合采用薄膜过滤法，可以作如下推断：所接种微生物的分离培养失败是由于该产 品的抑菌活性。此信息表明该产品未被指定(上述给定)的微生物所污染(此信息表明该 产品大概不会被上述给定的微

4、生物所污染)。应继续进行监测以建立该产品的抑菌谱和杀菌 活性范围。缓冲液和培养基培养基既可以按以下处方配制，也可以使用生产者或销售商推荐的，与该配方相类似 的脱水培养基。按以下程序配制培养基：将可溶性同体溶解在水屮，必要时可加热促使英完全溶解， 用hci或naoh溶液调节培养基的ph使其在使用时达到规定值。在25 士 2°c时测定ph 值。如果配方中有琼脂，则琼脂的含水量不应超过15%,配方中的水均应为纯水。ph 7.2磷酸盐缓冲液储备液一在1000ml容量瓶中将磷酸二氢钾kh2po434g （monobasic potassium phosphate）溶于约500ml水中，用nao

5、h ts （约175ml）调节ph至7.2±0.1 o加水至 刻度，混匀。分装，灭菌。冷藏保存备用。培养基除非另有规定，培养基均应采用高压蒸汽灭菌方式（见灭菌项1211下，蒸汽灭菌）, 灭菌时间取决于待灭菌的培养基的体积。i.酪蛋东人豆卵磷脂聚山梨醇酯20液体培养基1pancreatic digest of casein酪蛋白胰酶消化物（胰酪腺）20 gsoy lecithin人豆卵磷脂5 gpolysorbate 20聚山梨醇酯2040 mliwater水960 ml将酪蛋口月东、大豆卵磷脂溶解在960ml水中，在温度为48-50° c水浴中加热约30分 钟使其完全溶解。

6、加40ml聚山梨醇酯20混合，按所需量分装。ii. 大豆酪蛋白水解物琼脂培养基pancreatic digest of casein酪蛋口胰酶水解物（胰酪月东）15.0 gpapaic digest of soybean meal大豆木瓜酶水解物5.0 gsodium chloridenaci5.0 gagar琼脂15.0 gwater水1000 ml灭菌后 ph7.3 ± 0.2oiii. 大豆酪蛋门水解物培养基按无菌检查项v 71 下犬豆酪蛋白水解物培养基的配制方法进行。iv. ii露醇盐琼脂培养基pancreatic digest of casein酪蛋白胰酶消化物（胰酪月东）

7、5.0 gpeptic digest of animal tissue动物组织胃酶水解物5.0 gbeef extract牛肉浸取物1.0 gd-mannitold 甘露醇10.0 gsodium chloridenaci75.0 gagar琼脂15.0 gphenol red酚红0.025 gwater水1000 ml将上述成分混合后，加热并不停不断地搅动，煮沸1分钟使之完全溶解。灭菌后ph7.4±0.2.v. baird-parker琼脂培养基pancreatic digest of casein酪蛋口胰酶消化物（胰酪月东）10.0 gbeef extract牛肉浸収物5.0 g

8、yeast extract酵母浸取物1.0 glithium chloride氯化锂5.0 gagar琼脂20.0 gglyci neu氨酸12.0 gsodium pyruvate内酮酸钠10.0 gwater水950 ml边加热边搅拌，煮沸一分钟。灭菌，冷却至45°c50°c,加入10ml灭菌的1%亚碼酸 钾溶液、50ml蛋黄乳化液，轻轻混合均匀，倾注平皿。（卵黄乳化液制备：将蛋壳表面消 毒，无菌条件下打开蛋壳，将完整的蛋黄分离至无菌量筒中。加入无菌盐水ts,使蛋黄 与盐水比为3 :70转移至一无菌搅拌杯屮高速搅拌5秒钟。）灭菌后ph6.8 ± 0.2.vi.

9、 vogel-johnson 琼脂培养基pancreatic digest of casein酪蛋口胰酶水解物（胰酪豚）10.0 gyeast extract酵母浸取物5.0 gmannitol甘露醇10.0 gdibasic potassiumphosphate磷酸氢二钾5.0 glithium chloride氯化锂5.0 gglyci ne甘氨酸10.0 gagar琼脂16.0 gphenol red酚红25.0 mgwater水1000 ml将固溶体（固体溶液）煮沸1分钟，灭菌，冷却至45°c 50°c,加入灭菌的1%亚碼酸钾溶液。灭菌j5ph7.2to.2ovii

10、. cetrimide琼脂培养基pancreatic digest of gelatin明胶胰酶水解物20.0 g<magnesium chloride氯化镁1 -4 grpotassium sulfate硫酸钾10.0 gagar琼脂13.6 gicetyl trimethylammonium bromide (cetrimide)澳化十六烷基三甲胺0.3 gglyceri n廿油（丙三醇）10.0 mlwater水1000 ml将所冇的固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使z完全溶解。灭菌后 ph7.2±0.2.viii.用于荧光检测的假单胞菌琼脂培养基pa

11、ncreatic digest of casein酪蛋白胰酶消化物10.0 gpeptic digest of animal tissue 动物纟fl织胃酶消化物10.0 gan hydrous dibasic potassium phosphate 无水磷酸氢二钾(k2hpo4 )1.5 gmagnesium sulfate (mgso4)硫酸镁1.5 gglycerinlt油10.0 mlagar琼脂1 5.0 gwater水1000 ml将固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使z完全溶解。灭菌后 ph7.2±0.2oix.用于检测绿脓菌素的假单胞菌琼脂培养基pa

12、ncreatic digest of gelatin 明胶胰酶消化物20.0 ganhydrous magnesium chloride 无水氯化镁(mg cl 2)1.4 ganhydrous potassium sulfate 无水硫酸钾(k2so4)10.0 gagar琼脂15.0 gglycerin甘汕10.0 mlwater水1000 ml将固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使z完全溶解。灭菌后 ph7.2±0.2.x.乳糖培养基beef extract牛肉浸提物3.0 gpancreatic digest ofgelatin明胶胰酶消化物5.0 glac

13、tose乳糖5.0 gwater水1000 ml灭菌后尽快冷却，灭菌后ph6.9 ± 0.2.xi.亚刖酸盐胱氨酸培养基pancreatic digest of casein酪蛋白胰酶消化物5.0 glactose乳糖4.0 gsodium phosphate磷酸钠10.0 gsodium acid selenite亚硒酸钠4.0 gl cystinel胱氨酸10.0 mgwater水1000 ml最终 ph: 7.0 ±0.2混合，加热使之溶解用流动蒸汽加热15分钟，不要高压灭菌。xii.连四硫酸盐培养基pancreatic digest of casein酪蛋白胰酶水解

14、物2.5 gpeptic digest of animal tissue动物组织胃酶水解物2.5 gbile salts胆盐1.0 gcalcium carbonate碳酸钙10.0 gsodium thiosulfate硫代硫酸钠30.0 gwater水1000 ml将固溶体（固体溶液）加热至沸腾。用时加由5g碘化钾和6g碘溶于20ml水屮配制而成 的溶液，之后加入10ml千分之一的亮绿溶液，混合，加入亮绿溶液后不要加热。xiii.亮绿琼脂培养基ryeast extract酵母浸提物3.0 gpeptic digest of animal tissue动物组织胃酶消化物5.0 gpancre

15、atic digest of casein酪蛋白胰廨消化物5.0 glactose乳糖10.0 gsodium chloride氯化钠5.0 gsucrose蔗糖10.0 gphenol red酚红80 mgagar琼脂20.0 gbrilliant green亮绿12.5 mgrwater水1000 ml将固溶体（固体溶液）煮沸1分钟，使用前高压灭菌，将培养基融化，倒入平皿屮，令其 冷却。灭菌后 ph 6.9 ± 0.2.xiv.木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂培养基xylose木糖3.5 gl-lysi nel赖氨酸5.0 glactose乳糖7.5 gsucrose蔗糖7.5 gsod

16、ium chloride氯化钠5.0 gyeast extract酵母浸提物3.0 gphenol red酚红80 mgagar琼脂13.5 gsodium desoxycholate去氧胆酸钠2.5 gsodium thiosulfate硫代硫酸钠6.8 gferric ammonium citrate 枸椽酸铁胺800 mgwater水1000 ml最终 ph: 7.4 ±0.2边搅拌便加热固态物与水的混合物至沸点，勿过度加热或高圧灭菌。立即转移至约50°c水浴屮，冷却后立即倒入平皿屮。xv.亚硫酸钮琼脂培养基beef extract 牛肉浸提物5.0 gpancrea

17、tic digest of casein 酪蛋口胰酶消化物5.0 gpeptic digest of animal tissue 动物纟织胃酶消化物5.0 gdextrose右旋葡萄糖5.0 gsodium phosphate 磷酸钠4.0 gferrous sulfate硫酸亚铁300 mgbismuth sulfite indicator 亚硫酸钮指示剂&0 gagar琼脂20.0 gbrilliant green亮绿25 mgwater水1000 ml最终 ph: 7.6 ±0.2.边搅拌便加热固态物与水的混合物至沸点，勿过度加热或高压灭菌。立即转移至约50°

18、c水浴中，冷却后立即倒入平皿中。xvi.三糖铁琼脂培养基pancreatic digest of casein酪蛋白胰酶水解物（腺）10.0 gpancreatic digest of animal tissue 动物组织胰酶水解物10.0 glactose 乳糖10.0 gsucrose 蔗糖10.0 gdextrose葡萄糖1-0 gferrous ammonium sulfate 硫酸亚铁霰200 mgsodium chloride 氯化钠5.0 gsodium thiosulfate 硫代硫酸钠200 mgagar琼脂13.0 gphenol red 酚红25 mgwater 水100

19、0 ml灭菌后 ph7.3±0.2.xvii.麦康凯琼脂培养基pancreatic digest of gelatin 明胶胰酶水解物17.0 gpancreatic digest of casein酪蛋白胰酶水解物1.5 gpeptic digest of animal tissue动物组织胃酶水解物1.5 glactose 乳糖10.0 gbile salts mixture 胆盐混合物1.5 gsodium chloride 氯化钠5.0 gagar琼脂13.5 gneutral red 中性红30 mgcrystal violet 结晶紫1.0 mgwater 水1000 m

20、l将固态物与水混合煮沸1分钟令其充分溶解，灭菌后ph7.1 ±0.2.xviii .levine eosin亚甲兰琼脂培养基（伊红美兰琼脂培养基）pancreatic digest of gelatin 明胶胰酶水解物10.0 gdibasic potassium phosphate 磷酸氢二钾2.0 gagar琼脂15.0 glactose 乳糖10.0 geosin y伊红（曙红）400 mgmethylene blue亚甲兰（美兰）65 mgwater 水1000 ml将明胶胰酶消化物、併酸氢二钾及琼脂溶解在温水中，冷却。用吋融化，按下述比例 加入其余组分并混合：每100ml琼

21、脂液中加入5ml 20%乳糖溶液2ml 2%伊红溶液以及 2ml 0.3% （1/300）的亚甲兰溶液。最终配好的培养基可能不是澄清透明的。灭菌后 ph7.1 ±0.2.xix. sabouraud葡萄糖琼脂培养基dextrose葡萄糖40 gmixture of equal parts of peptic digest of animal tissue and pancreatic digest of casein动物组织胃酶水解物与酪蛋白胰酶水解物的等量混合物10 gagar琼脂15 gwater 水1000 ml混合；煮沸使之完全溶解。灭菌后ph 5.6 ±0.2.x

22、x.马铃薯葡萄糖琼脂培养基cook 300 g of peeled and diced potatoes in 500 ml of water prepared by distillation, filter through cheesecloth, add water prepared by distillation to make 1000 ml, and add the following:将300克去皮的马铃薯片加入500ml蒸镉水蒸煮，用cheesecloth （纱布）过滤，加蒸馆水至1000ml, 然后加入下述成分agar琼脂15 gglucose葡萄糖20 g加热溶解，灭菌。灭菌

23、后ph5.6±0.2.倾倒平皿之前，在熔融后冷却至45°c的培养基屮加入无菌10%酒石酸溶液调节ph3.5 ± 0.1 o勿将ph 3.5的培养基再次加热。检验量各专项试验一次试验所用的供试品量为10ml或10g.供试液的制备程序应根据试样的物理性状选择适宜的方法制备供试液，该制备方法还应不影响原有的微 生物的种类和数量。供试液可以是来源于供试品的全部或部分的溶液或混悬液，只要适宜 于将要进行的检测程序。对那些有着明显的溶解，但不能完全溶解的固态供试品，可将其适当地粉碎成细粉， 并将其悬浮在指定的赋形剂中，按需氧菌总数计数、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 检杳以及沙

24、门菌属、大肠埃希菌检杳项下的规定进行。由真溶液组成的液休供试品，或由水或浓度小于30%乙醇作为赋形剂配成的混悬液供 试品以及那些几乎完全溶解于90ml ph7.2的磷酸盐缓冲液小或指定的培养基屮的固态供 试品，按需氧菌总数计数、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查以及沙门菌属、 人肠埃希菌检查项下的规定进行。对于与水不混溶的液体、软膏（油膏）、乳剂、蜡制品，其混悬液制备可按下述方法进行：加入最小量的合适的无菌乳化剂（例如：一种聚山梨醇酯），机械搅拌，必要时温热至 温度不超过45。按需氧菌总数计数、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查以及沙 门菌属、犬肠埃希菌检查项下的规定进行。对于气雾剂供试品，将容器

25、置于乙醇一干冰混合物中冷却约1小时，钻开容器，放置 室温，使抛射剂释出，如有可能，可加温排出抛射剂。按检测要求的量，依前述两个程序 z的要求将一定量的供试品以适当的方式转移。如果不能从10个气雾剂形式的容器小 获得10g或10ml供试品，则可将冷却的容器中的内容物全部转移到培养基中，令抛射剂 释出， 用残留物进行检测。若检测结果不确定或可疑，可从20个或更多的容器中取样重 新检查。总需氧菌计数平皿法用于完全溶解的供试液或允许采用平皿法的半透明供试液，其他供试液采用多管 法进行检查。无论用那种方法，都必须首先准确称量或量取供试品10g （当供试品为固态 吋）或10ml （当供试品为液态吋），将其

26、溶解或悬浮在ph 7.2磷酸盐缓冲液，犬豆一酪蛋 白水解物液体培养基，或酪蛋白水解物一大豆卵磷脂一聚山梨醇酯20液体培养基中，使成 100mlo如果稀释级为1:10时供试液过于粘稠，不能用移液管移取，可将供试液稀释（仁 50,或1：100）直至可以移取。在进行总需氧菌检查z前，应按预试验preparatory testing 项下的规定进行验证，确认不存在抑菌活性。应在适宜稀释级的供试液制备后1小时内将 其加入到培养基中用丁接种培养。平皿法必要时，将供试液继续稀释，使加入1ml供试液培养后的菌落数在30-300个。分别向 两个无菌平皿中加入1ml终稀释级供试液，每皿注入15-20ml融化后冷却

27、至45°c的大豆 酪蛋白水解物琼脂培养基，盖上平皿，轻轻敲打或旋转使样品与琼脂培养基混合，室温凝 i占i。倒置培养4872小时后，检查菌的生长，计数菌落数。取两个平皿每克或每毫升供试 液的需氧菌数的平均值报告菌数。如果在稀释级为仁10的样品平皿屮未发现微生物菌落, 则将该结果表示为每克或每毫升样品中菌数小于10个。多管培养法取14支规格类似的试管，分别加入9ml大豆酪蛋白水解物液体培养基。将其中12 支分成四组，每组3支。除对照组3支外，在第一组（“100”）三支管中以及第四支管（管 a）屮加入1ml供试品溶液或混悬液，混匀。取1ml管a屮的内容物移入至另一个分组后 剩余的管中（管b

28、）,混匀。管a和管b中分别含有供试液100mg（或100ul）和伽g（或10ul）.o向第二组（“10”）的3支试管中分别加入管a的内容物1ml, 向第三组（“”） 的3支试管中分别加入管b的内容物1ml,废弃管a、管b中剩余的内容物。将各试管封 严，培养。检查各管中微生物的生长情况，对照管应澄清，含供试液的样品管参照表1 整理实验数据，可以给出每克或每毫升供试液屮最可能的微牛物的数量。表1多管培养法最可能的微生物总数observed combinations of numbers oftubes showing growth in each set每组中长菌管总数most probable

29、number of microorganisms per g or per ml 每克或每毫升供试液中最可能的微生 物的数量no. of mg (or ml) of specimen per tube每管中的供试詁量100(100 nl)10(10 hl)1(1 pl)333>1100332110033150033020032329032221032115032090313160312120311703104030395302603014030023金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查在供试液中加入人豆酪蛋白水解物培养基使成100ml ,混匀后培养。检查培养基中菌的生长情况。如果有菌生长，用

30、接种环将培养物划线接种于vogel-johnson琼脂培养基表而（或baird-parker琼脂培养基，或ft露醇盐琼脂培养基丿以及cetrimide（混化十六 烷基三甲钱）琼脂培养基表面，倒置培养。如果每个平皿中均未发现具有表2、3所列特性 的菌落，则判该供试品未检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。表2、金黄色葡萄球菌在选择培养基中的形态特征选择培养基菌落形态特征革兰氏染色vogel-johnson琼脂培养基黑色、外围有黄色环阳性球菌甘露醇盐琼脂培养基黄色、有黄色环阳性球菌baird-parker琼脂培养基黑色，有光泽，外围有2-5mm透明环阳性球菌表3、铜绿假单胞菌在选择培养基中以及检定琼脂

31、培养基中的形态特征选择性培养基菌落形态特征紫外灯卜荧光氧化酶试验革兰氏染色centrimide 琼脂培养基通常为浅绿色浅绿色阳性阴性杆菌用于荧光检测的假 单胞菌琼脂培养基通常为无色至淡黃色淡黃色阳性阴性杆菌用于绿脓菌索检测 的琼脂培养基通常为浅绿色蓝色阳性阴性杆菌血浆凝固酶试验（用于金黄色葡萄球菌）：用接种环从vogel-johnson琼酯培养基（or baird-parker琼酯培养基，or mannitol-salt琼酯培养基）表面挑取可疑菌落转移至含0.5ml 哺乳动物血浆的试管中（最好是兔血浆或马血浆，冇添加剂v保护剂或无添加剂v保护剂 的血浆均可），37°c水浴，3小时后开

32、始观察，随后以适当的间隔观察直至24小时。阴 性对照和阳性对照与未知样品同时检测。如杲没有观察到任何凝集，判该供试品未检出金 黄色葡萄球菌。氧化酶与色素试验（用于铜绿假单胞菌）：用接种环从cetrimide（澳化i六烷基三甲鞍） 琼脂培养基表面挑取可疑菌落分别接种至含用于荧光检测的假单胞菌琼脂培养基和用于绿 脓菌素检测的假单胞菌琼脂培养基的平皿上，如果要转移的菌落数量较多，可以将每个平 皿分成四个扇形部分，每部分接种一个单独的菌落。盖上平血，于35±2°c倒置培养至少 3天。在紫外灯下检查划线接种表面，并检查菌落是否具冇表3所列特征。通过氧化酶试验确证在铜绿假单胞菌培养基上生长的任何可疑的菌落。在冇菌落生长的 平皿上放置预先用二盐酸n,n二甲基对苯胺浸渍的滤纸条或|员|片，也可将菌落转移到前述 滤纸条或圆片上。若颜色没冇从粉色变为紫红色，则判该供试品未检出铜绿假单胞菌。如 有必要，可采用其它适宜的培养和生化试验确认是否为铜绿假