有氧运动对高脂肥胖大鼠心肌自由基代谢及胸主动脉血管eNOSmRNA表达水平的影响

1、    有氧运动对高脂肥胖大鼠心肌自由基代谢及胸主动脉血管enosmrna表达水平的影响    程爱佳 李光华 韩梅摘 要：目的：探讨有氧运动对高脂饮食肥胖大鼠胸主动脉血管enos mrna表达水平及自由基代谢作用。方法：根据饮食结构不同将sd大鼠随机分为3组（n=10），正常饮食组（cn）、高脂蛋白组（hd）、高脂蛋白复合有氧运动组（he），he大鼠每天游泳1次，90min/次，每周运动5天，持续8周。取心肌及胸主动脉。检测sd大鼠体重，lees指数，心肌中超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda），胸主动脉血管enos 

2、mrna表达水平的影响。结果：与正常饮食组相比，高脂蛋白组心肌中的mda含量升高，sod含量降低（p<0.01）。与高脂蛋白组相比，高脂蛋白复合有氧运动组心肌mda含量降低，sod含量增加（p<0.01）。正常饮食组enos mrna基因表达水平显著高于高脂蛋白组（p<0.05），高脂蛋白复合有氧运动组enos mrna基因表达水平高于高脂饮食组（p<0.05）。结论：有氧运动可改善胸主动脉enos mrna表达水平，其机制可能与增强抗氧化酶活力、减少自由基产生有关。关键词：有氧运动;高脂;enos mrna;自由基随着社会的发展

3、，肥胖已经成为当代社会的一个重要问题1。大量流行病学研究表明，肥胖与高血压、冠心病、高脂血症、糖尿病及某些肿瘤疾病发生有关2。肥胖是指一定水平上的脂肪层过厚与显著超重，是因为机体摄入的热量远远大于消耗的热量，从而导致体内的脂肪组织不能被消耗、利用，积存过多致使体重不断增长，机体因此发生一系列生理与病理改变。肥胖对心血管影响研究的很多，而运动对肥胖心血管影响研究得较少。本实验旨在研究适量运动对高脂蛋白饮食所致的肥胖大鼠主动脉血管内皮性一氧化氮合酶（enos）基因表达水平与氧化代谢反应的影响，以探讨通过有氧游泳运动改善肥胖患者心血管功能状态的可能性及其机理。一、主要材料与方法（一）实验材料（1）实

4、验动物。雄性sd大鼠（宁夏医科大学实验动物中心提供）30只，体质量180g左右，随机分为3组，正常饮食组（cn）、高脂蛋白组（hd）、高脂蛋白复合有氧运动组（he），每组10只，温度环境为24°c，分笼饲养，高脂蛋白飲食8周，筛选出运动能力相近的大鼠。（2）试剂与药品。mda（malondialdehyde，丙二醛）测定试剂盒、sod（super oxide dismutase，超氧化物歧化酶）等，chol（总胆固醇）、tg（三酰甘油）、hdl（高密度脂蛋白）、ldl（低密度脂蛋白）全自动生化分析仪，核糖核酸（rna）提取液及反转录试剂盒。（二）肥胖大鼠模型制备1

5、.肥胖大鼠饲料营养成分cn组：按每200g含38g蛋白质、8g脂肪、132g糖、8g矿物质、9g纤维素、酒石酸氢胆碱0.3g、1.9维生素，普通饲料均为颗粒状。高脂蛋白饮食组，按高脂蛋白饮食饲料喂养，高脂饮食成分包括：巧克力、甜饼干、牛奶和花生，比率为2226;蛋白质为40%、脂肪为40%、糖为38%、纤维素为8%。正常标准饮食的热量为5.2kcal/g。高脂蛋白饮食热量为6.1kcal/g（相当于脂肪热量的45%），2.大鼠游泳运动模型cn与hd两组大鼠常温环境下分笼饲养，正常活动不进行运动训练（游泳）。高脂蛋白饮食复合有氧运动组大鼠进行有氧游泳运动训练。游泳塑料大桶直径为62cm的，水深度

6、约为65cm，水温度约为32±1。he组大鼠在前3天分别游泳时间逐渐递增，分别每天为30、60和90min，然后适应性游泳1周后，开始正式游泳训练，连续8周，每天游泳时间固定为90min。期间，游泳运动训练每周5天，周三与周天休息。（三）血清处理方法样品制备等大鼠8周游泳有氧运动结束后，禁食24小时即可，采用20%乌拉坦（0.5ml·kg1体重）通过大鼠腹腔麻醉，注射针头刺入心脏内直接采全血5ml，高速离心30min，吸取上部血清，置于-80低温冰箱保存、待测。心脏组织有眼科剪迅速剪取小片心脏组织，然后用0.85%的生理盐水冲洗，然后用滤纸吸干。按重量（w（g）：体积（v（

7、ml）=19生理盐水制成浓度为10%组织匀浆液。根据试剂盒要求处理、离心后，抽取上清液，放-80冰箱保存、待用。（四）基因指标检测大鼠胸主动脉内皮性一氧化氮合酶（enos）mrna基因表达水平的测定。1.引物设计与合成根据national center for biotechnology information（ncbi）上大鼠enos的mrna数据与信息，作者提出要求，由北京生物工程有限公司设计引物并合成，并按要求分离与提取总rna：参照axygen rna 提取试剂盒步骤说明，提取大鼠胸主动脉血管环标本中总rna。2.核糖核酸（r

8、na）反转录及扩增总量为40ul的反应体系，约16l提取的总rna，2l随机六聚体引物，1loligo（dt）18 primer，1l无酶水，3040pmol基因特异性引物，4l5xreaction buffer，4l10mmdntp mix，2lribolocktm rna酶抑制剂，2lrevertaidtmmmulv逆转录酶。采用反转录试剂盒（北京全式金）进行逆转录，在37反转录60min后，90变性5min，室温环境下高速离心5s后获得rt产物（cdna），然后进行pcr反应。3.聚合酶链式反应（pcr）的定量测定往pcr管中加入qpcr×

9、;21ul 4 supermix液，cdna模板各2ul，加入为20um浓度的上、各管加21 ul无酶水、下游引物各1ul。21ul 4×qpcr supermix，1ulreverse primer（10um），1ulforward primer（10um），1ul模板cdna，10.5 ulddh2o，反应条件预变性：945min，变性：9430s，退火：6030s延伸：7230s，循环数36个。4.超氧化物歧化酶（sod）及丙二醛（mda）等指标的测定心肌组织中sod的检测采用硫代巴比妥酸（tba）

10、法、mda的测定采用wst1法测定，血液相关指标测定：采用全自动生化仪测定血中、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（hdl）、低密度脂蛋白胆固醇（ldl）的含量。5.统计学方法数据均采用spss21.0软件进行统计学处理和分析，均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，差异有无统计学意义以p<0.05表示。二、结果（一）有氧游泳运动对高脂蛋白饮食肥胖大鼠体质重量的影响由表1结果可以看出，各组大鼠体质重量随着周龄的增加，体重也在逐周增长，在游泳有氧运动八周后，高脂蛋白饮食组与正常饮食组相比较，体重增加更明显（p<0.01）;与高脂饮食组相比较，高脂饮食有氧

11、运动组体重增长量下降（p<0.01）。与正常饮食组为对照p<0.05，p<0.01;与高脂蛋白饮食组为对照#p<0.05，#p<0.01。（二）有氧游泳运动对高脂蛋白饮食肥胖大鼠lees指数的影响由表2结果可以看出：正常饮食组lees指数明显低于高脂蛋白饮食组（p<0.01），与高脂蛋白饮食组lees指数比较，高脂蛋白饮食复合有氧运动组lees指数明显下降（p<0.05）。（三）有氧游泳运动对高脂蛋白肥胖大鼠心肌自由基（sod、mda）代谢的影响如图1结果所示，与正常饮食组比较，高脂蛋白饮食组超氧化物歧化酶（sod）活力在心肌组织中的表达水平明显下降（

12、p<0.01）;与高脂蛋白饮食组比较，高脂蛋白饮食复合有氧运动组心肌超氧化物歧化酶（sod）活力则显著升高（p<0.01）;由图2结果可得知，与正常饮食组比较，高脂蛋白飲食组丙二醛（mda）在心肌组织中含量显著升高（p<0.01）;与高脂蛋白饮食组比较，高脂蛋白饮食复合有氧运动组心肌mda含量升高（p<0.01）。与正常饮食组为对照p<0.05，p<0.01;与高脂蛋白饮食组为对照#p<0.05，#p<0.01。与正常饮食组为对照p<0.05，p<0.01;与高脂蛋白饮食组为对照#p<0.05，#p<0.01。与正常饮食组

13、为对照p<0.05;与高脂蛋白饮食组为对照#p<0.05。（四）有氧游泳运动对高脂蛋白饮食肥胖大鼠胸主动脉内皮性一氧化氮合酶（eno）s mrna表达水平的影响由图4结果显示：高脂蛋白饮食组enos mrna基因表达水平显著低于（p<0.05）正常饮食组，而高脂蛋白饮食复合有氧运动组中胸主动脉血管enos mrna基因的表达水平显著高于高脂蛋白饮食组（p<0.05）。三、讨论肥胖是导致心血管疾病的一个重要因素3，本实验与普通饮食组比较，高脂饮食组体重是明显增加，肥胖造模成功的标准是高于普通饮食对照组体重的20%，以此为参考，本实验造模成功，

14、与国内大多数研究者的饮食诱导单纯性肥胖大鼠模型的造模程度相符45。这可能与在自由饮食的条件下，高脂饮食的摄取能够诱发肥胖鼠体脂含量增加，而不简单是食物摄入量的增加，这与摄食效率相关6。有氧运动可以增加机体对体内堆积的脂肪组织的燃烧和消耗，使机体脂肪量逐步下降，lees指数与脂肪含量成正相关系，本实验结果显示：高脂饮食组lees指数明显高于普通饮食组（p<001），与高脂饮食组比较，高脂饮食运动组lees指数有所下降，无统计学差异（p<0.05）。说明肥胖与lees指数有着密切关系。dborina7等实验证实，将sd大鼠制成肥胖模型后，肥胖组大鼠大动脉mda显著上升。本研究的结果也验

15、证这个现象，这很可能是肥胖患者可造成机体物质代谢功能的异常改变，如，脂肪酸和不饱和脂肪酸的代谢不全，致使血浆游离脂肪酸（ffa）升高，同时，高脂蛋白饮食诱导的肥胖还可产生大量的自由基，超出了机体正常清除能力，在氧化酶的作用下，最终导致mda的堆积与增多。大量有研究结果显示：机体通过各种不同形式的运动，可以持续改善机体物质代谢的水平与能力，如可以显著提升机体超氧化物歧化酶（sod）活性，这样，就增强了机体清除氧自由基的能力。本研究结果显示，与正常饮食组比较，高脂蛋白饮食组超氧化物歧化酶（sod）活力在心肌组织中的表达水平明显下降（p<0.01）;与高脂蛋白饮食组比较，高脂蛋白饮食复合有氧运

16、动组心肌超氧化物歧化酶（sod）活力则显著升高（p<0.01）;且与正常饮食组比较，高脂蛋白饮食组丙二醛（mda）在心肌组织中含量显著升高（p<0.01）;与高脂蛋白饮食组比较，高脂蛋白饮食复合有氧运动组心肌mda含量升高（p<0.01）。表明有氧游泳运动能够增强机体物质代谢能力，提高机体抗氧化酶活力，减轻高脂饮食后脂质过氧化反应，本研究与相关文献报道一致8。no是由一氧化氮合酶（enos）催化其底物l精氨酸（larg）所产生，是内皮细胞分泌的一种活性物质，它由内皮细胞合成并释放，通过弥散作用与血管平滑肌，能够使血管平滑肌细胞松弛，在调节血管舒缩功能中具有十分重要的作用和意义

17、。血液中enos主要来自血管内皮细胞9，有氧运动可以增加内皮性一氧化氮合酶（enos）的基因表达水平。本实验结果显示，高脂蛋白饮食组enos mrna基因表达水平显著低于（p<0.05）正常饮食组，而高脂蛋白饮食复合有氧运动组中胸主动脉血管enos mrna基因的表达水平显著高于高脂蛋白饮食组（p<0.05）。这也进一步说明有氧游泳运动能使皮性一氧化氮合酶（enos）基因表达上调从而改善血管内皮功能。综上所述，有氧游泳运动可以使高脂蛋白饮食肥胖大鼠动脉血管enos mrna基因表达上调，改善其自由基代谢水平。其机制可能是有氧游泳运动可增强机体物质代谢水

18、平，增强抗氧化酶活力，抵抗脂质过氧化物损伤有关，但其调控的详细机制还有待于今后进一步深入的探讨与研究。参考文献：1world health organization.prevention and management the global epidemic of obesity.report of the who consultation on obesity：who，1998，9.2westerterp kr.perception&#

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