【精品】单抗的制备、纯化和鉴定

1、单抗的制备、纯化和鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞 融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单-克隆抗体制备的原理、 主要步骤和方法。二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能人量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免 疫的b淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与 骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具冇骨髓 瘤细胞能无限制壇殖的特性，又具冇免疫b细胞合成和分泌特异性抗体的能力。 经在hat培养基含冇次黄瞟吟(h)、氨基喋吟(a)和胸腺卩密喘核昔(t)中进行 选择性培养，未融合的脾细胞因不

2、能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细 胞合成dna的主要途径被培养基中的氨基蝶吟阻断，又i大i缺乏次黄卩票吟-鸟卩票 吟-磷酸核糖转移酶(hgprt),不能利用培养基中的次黄嚓吟完成dna的合 成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嚓吟-鸟瞟吩 磷酸核糖转移酶，因此能在hat培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选 出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大 量制备单克隆抗体。三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平血、酶标仪、加样器、细胞计数板、c02培养 箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1 抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫

3、原性较强的抗原。a.可溶性抗原(蛋口质)以lmg/ml5mg / ml的溶液加等量的弟氏完 全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为03ml06ml,间隔35周再同 样注射一次，1 0天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试 验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原02ml04ml, 34天 后，杀死小鼠取脾做融合用。b.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔 时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以1 %浓度每只皮下注射02 ml,每周2 次，共免疫58次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂 量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物

4、；目前应用最广的是小口鼠和大口鼠，尤以小口鼠为好。就品系而言以ba lb/ c小白鼠应用最广，因为所有的小口鼠骨髓瘤系均从balb/c小口鼠系诱导出来。 balb/ c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8-12周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上, 发展了小鼠一大鼠，小鼠一人以及人一人杂交瘤技术。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单-克隆抗体的关键之正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的b淋巴细胞，一只纯种小白鼠估 计能产生10x10750x107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞 与小鼠骨髓瘤融合，只能冇t万分之一的机会获得某一种特定

5、抗体。所以为了提 高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的b淋巴细胞人 量增加。b淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很人影响。有人认为处在 转化时期的b淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7-8天，虽然是抗体产生 的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫 后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备;脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的balb/c鼠，拉颈或用c02处死小白鼠。(2) 将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3) 把脾放入5ml含有25%fcs的1640液中，冰浴下轻轻洗去

6、脾上的红血 球。(4) 用银子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5) 直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6) 以25%fcs1640充满离心管，并以400g离心7minlomin (与此 同吋应开始制备骨髓细胞)。(7) 把沉淀用约loinl的新鲜培养液再悬浮。(8) 重复、步骤。(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高丁 80%为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影 响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤 细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：

7、该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品 系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生y 球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，最好10 &个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。目前常用的balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：s194/5xxo-bu-1； sp2/0agl4 (简称 sp2) ； ®p3/x63-ag8.653(x63-ag8.653)(简 称 653)；f0以653最为常用，它是由矿物油4一甲基一15烷(pristane,降植烷)诱发出 来的一种浆细胞瘤(minerol oil plasmacy toma,

8、mopc)并经过培育形成 一株8氮鸟ii票吟有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195°c液氮罐屮，试验时复 苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要 胰酶处理。为了防止出现返祖现彖，在融合前，可将培养基内加入15pg/ml 8 氮鸟瞟吟。取约1x1076x1(/对数生长期(即培养15h20h)的骨髓瘤 细胞，在室温离心(400g) lomin,沉淀以2.5%fcs-1640液再悬浮并计 数。饲养细胞在休外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入 其它活的细胞才能使其牛t繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(feede

9、r cell)。 在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长 繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以 做饲养细胞，如止常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细 胞，其屮主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲 养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长 造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种 类的小鼠，如c57鼠，昆明小白鼠等。(1) 拉颈处死小鼠。(2) 70%酒精浸泡消w 10mino(3) 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出

10、腹腔。(4) 用注射器将4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉lmin仍用该注 射器冋抽腹腔液体，加入离心管。(5) 1 000r/ min 离心 10mino(6) 取上清，以hat选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞， 使每毫升含40万个活细胞。（7）以lml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml,含2万个细胞，放入 co2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔 中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。4、细胞融合；小鼠骨髓瘤可以在体外培养液屮生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小 鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的b淋巴细胞在一般

11、培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗休的b淋巴细胞在融合因子（聚乙二 醇，peg）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性， 乂具有b淋巴细胞分泌特杲性抗体的能力，在hat选择培养基中可以选择得到 杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁 殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某b淋巴细胞产物一一单克隆抗体。（1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将10*小鼠脾细胞与1 -5x1 07sp2/0小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管屮，经1000转/分离心7 分钟；（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀

12、如糊 状，离心管置37°c水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3）、将37°c水浴中保温的50%peg1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓 慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37°c水浴中边滴边摇边离心管，使细 胞保存在混匀状态；4）、加完peg后，将细胞悬液放在37°c水浴中静置90秒钟，立即在2-4 分钟内加入15毫升无血清的rpmi-1640培养基（37°c）,开始要一滴一滴地 加，由于稀释使peg停止作用。注意尽可能不搅动细胞；5）、再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升hat培养液，轻 轻混匀，将混悬液分装已有巨

13、噬细胞的两个24孔培养板中，每孔05毫升；6）、将培养板放在水蒸汽饱和co?孵箱中，37°c孵育。co?含量为5%；7）、每2-3天换一次hat培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周 后使用ht培养基。5、杂交瘤细胞的选择培养；一般在融合24小时后，加hat选择培养液。ht和hat均有商品化试剂 50x贮存，用时lml加入50ml 20%小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200|jl/孔。所以在加选 择培养液时应加3倍量的hat。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2 / 3进行选择，可得到满意的筛选结果。50xhath: 5x10_3ma:

14、2x10_5mt: 8x10_4m一般选择hat选择培养液维持培养两周后，改用ht培养液，再维持培养 两周，改用一般培养液。6、杂交瘤细胞的筛选筛选朵交瘤细胞通过选择性培养而获得朵交细胞系中，仅少数能分泌针对免 疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即口丁开始检测 特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法, 一般以快速、简便、特异、墩感的方法为原则。常用的方法有：1elisa用丁诃溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等mcab的检测。乙 ria用于可溶性抗原、细胞mcab的检测。3. facs（荧光激活细胞分类仪）

15、用于检查细胞表面抗原的mcab检测。4. ifa用于细胞和病毒mcab的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具休的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。7、杂交瘤细胞的克隆化克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。舉为经过hat筛选后的杂交瘤 克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的 克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特界性抗体） 分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。 克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分 泌的细胞会被抗体

16、非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的牛长速度比抗体 分泌的细胞牛长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化 过的朵交瘤细胞也需耍定期的再克隆，以防止朵交瘤细胞的突变或染色体丢失， 从而丧失产生抗体的能力。（一）克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1. 有限稀释法的程序%1 制备饲养细胞悬液（同融合前准备）%1 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在15x10 3 / ml%1 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ ml, 100/孔加a、b、c三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9m i含饲养细胞的完全培养液，

17、细胞数为10个/ml, 100|jl/孔加d、e、f三排, 为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液， 细胞数5个/ml, 100pl/孔，加g、h两排，为每孔0.5个细胞。%1 培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养 液 200|jl/ 孔。%1 第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液屮加ht。2. 软琼脂法%1 软琼脂的配制含20%fcs（小牛血清）的2倍浓缩的rpmi16401 %琼脂水溶液：高压灭菌，42°c预热。0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍

18、浓缩的rpmi 1640配制而成。置42°c保温。%1 用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿 屮，在室温屮待凝固后作为基底层备用。%1 按100/ml, 500/ml或5000 / ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。%1 1ml 0.5%琼脂液（42°c预热）在室温屮分别与lml不同浓度的细胞悬 液相混合。%1 混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育 于37°c, 5%co2孵箱中。%1 45天后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含饲养 细胞的24孔板屮进行培养。%1 检测抗体，扩大培养，必耍时再克

19、隆化。8、单克隆抗体的检定；对制备的mcab进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1. 抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其 抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用elisa、ifa法。例如制 备抗黑色素瘤细胞的mcab,除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤 细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗 体。制备抗重组的细胞因了的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋 白有交叉反应，其次是与其它细胞因了间有无交叉。2. mcab的丨g类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体 进行筛选时，已经基本上确定

20、了抗体的ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记 的兔抗鼠igg或igm,则检测岀来的抗体一般是igg类或igm类。至于亚类 则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心elisa来确定mcab的亚类。在作 双扩试验时，如加入适量的peg(3%),将有利于沉淀线的形成。3. mcab中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定mcab的 生物学活性。例如如果确定抗病毒mcab的中和活性，则可用抗体和病毒同时 接种于易感的动物或敏感的细胞，來观察动物或细胞是否得到抗体的保护。4. mcab识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法， 测定mcab所识别抗原位点，来确定mcab的识别的表位是否相

21、同。5. mcab亲和力的鉴定：用elisa或ria竞争结合试验来确定mcab 与相应抗原结合的亲和力。9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立1. 杂交瘤细胞的冻存及吋冻存原始孔的朵交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的吋 候，细胞的培养过程屮随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如 果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支 安甑含1x106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在 24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓶冻存。细胞冻

22、存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；1 0%dmso (二甲 基亚砚)o冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0°c后放 入-7ctc超低温冰箱，次口转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细 胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年 或更长时间。2. 细胞复苏方法 将玻璃安甑口液氮中小心取出，放37°c水浴中，在1 min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制 备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37°c、5%co2孵箱屮培养，当细胞形成集 落时，检测抗体活性。10、单克隆抗体的大量

23、制备大量生产单克隆抗体的方法主要冇两种：1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清屮获取单克隆抗体。 但此方法产量低，一般培养液含量为1060pg/ml,如果大量生产，费用较 咼。2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。%1 实体瘤法 对数生t期的杂交瘤细胞按13xl07/ml接种于小鼠背 部皮下，每处注射0.2 ml,共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般1020 天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到l-10mg / mlo但采血量有 限。%1 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5ml pristane(降植烷)或液体石 腊于balb/c鼠，12周后腹腔注射1 xl06个杂交

24、瘤细胞，接种细胞71 0天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而 小鼠频丁死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1 10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量 可达5-20mg/ml,这是目前最常用的方法，还口j将腹水中细胞冻存起來，复 苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。1 1单克隆抗体的提纯1. 材料(1) 20mmol/l ph7.879trishci 缓冲液 20 mmol/l naci(2) 20mmol/l ph7879tishci 缓冲液 40mmo"l naci(3) 20mmol/l p

25、h7879tishci 缓冲液 80 mmol/l naci(4) 20mmol/l ph7879tishci 缓冲液(5) 饱和硫酸钱液(6) deae纤维素柱2. 操作方法(1) 小鼠腹水用冷pbs液稀释4倍后，于1.00x105转离心30min,去沉 淀。(2) 在4于上清屮缓缓滴加饱和硫酸按液，边加边搅拌，使溶液最终为50% 硫酸钱浓度。(3) 此溶液置冰中30min60min,然后5 000r/min离心lomin,去上清。(4) 将沉淀溶于tris-hci缓冲液(40inmol/l naci)中(溶液可能混浊)。(5) 装入透析袋于tris-hci缓冲液(20 mmol/l nac

26、i)中透析除盐。(6) 离心去沉淀。(7) 溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后，于280nm测蛋白含量，佔计蛋白 质含量1a 280unit=0.8mg 蛋白质一般每ml腹水屮，含有总蛋白约25mg36mg。(8) 过deae纤维素柱：纤维素柱高40cm,以20mmol/l naci tris缓 冲液平衡。透析样品以tris缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为lml2rnl/rriiri,以naci线形梯度洗脱。人部分单克 隆igg于40 mmol/l和80mmol/l naci洗脱，也冇极少例外的单克隆抗体 于 120 mmol/l -150 mmol/l naci 洗脱。测od280nm收集蛋白峰，单克隆igg保存备用。杂交瘤产牛各种免疫球蛋口，但主耍是igg和igm,究竞是哪种为主，则决定于抗原的免 疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生igm的b淋巴细胞。免疫多次的多为iggo 12、影响因素、失败原因分