定基因工程的概述

1、能发能发荧光荧光的热的热带斑带斑马鱼马鱼普通热带斑马鱼是不发荧光的普通热带斑马鱼是不发荧光的第一节第一节 基因工程的概述基因工程的概述 又叫又叫基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。指在指在体外体外通过通过人工人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”等方法，对生物的基因进行等方法，对生物的基因进行改造和重改造和重新组合新组合，然后导入受体细胞，然后导入受体细胞，并使重并使重组基因在受体细胞中表达组基因在受体细胞中表达，产生人类，产生人类需要的基因产物的技术。需要的基因产物的技术。一、一、 什么是基因工程什么是基因工程 获得获得人类所需的基因产物人类所需的基因产物 结结 果果 剪切、

2、拼接、导入、表达剪切、拼接、导入、表达基本过程基本过程 DNADNA分子水平分子水平操作水平操作水平 基基 因因操作对象操作对象 生物体外生物体外操作环境操作环境基因拼接技术、基因拼接技术、DNADNA重组技术等重组技术等 别别 名名一、限制性核酸内切酶“分子手术刀” 主要来源：主要来源： 种类与命名：种类与命名： 作用特点：作用特点： 4.4.限制酶识别序列限制酶识别序列 5.5.作用结果：作用结果：种类与命名： 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus i

3、nfluenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:Hind、Hind和Hind磷酸磷酸二酯键二酯键识别识别DNADNA特定的序列特定的序列, ,使使DNADNA分子链的固定部位分分子链的固定部位分开。开。. .黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端二、二、“分子缝合针分子缝合针” DNA DNA连接酶连接酶催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶化学本质化学本质作用部位作用部位模板模板磷酸二酯键磷酸二酯键（单个脱氧核单个脱氧核苷酸苷酸+ +片段片段“分子运输车分子运输车”质粒质粒

4、质粒：裸露、结构简单、质粒：裸露、结构简单、独立于细菌染色体之外，独立于细菌染色体之外，具有自我复制能力的双具有自我复制能力的双链链环状环状DNADNA分子分子。1 1、至少有、至少有一个（多个）限制酶切割位点一个（多个）限制酶切割位点，供外，供外源源DNADNA片段插入其中。片段插入其中。2 2、重组运载体进入受体细胞后（或整合到染色、重组运载体进入受体细胞后（或整合到染色体、体、DNADNA上），上），在受体细胞存在并进行自我复在受体细胞存在并进行自我复制制。3 3，有特殊的遗传标记基因有特殊的遗传标记基因，如抗四环素、氨苄，如抗四环素、氨苄青霉素等标记基因，供重组青霉素等标记基因，供重组

5、DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。DNADNA重组技术的重组技术的三件工具：三件工具：限制性内切酶、限制性内切酶、DNADNA连接酶、连接酶、运载体。运载体。总结总结质粒质粒目的基因目的基因限制性限制性内切酶内切酶连接酶连接酶重组质粒重组质粒基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因

6、2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成概念：概念：基因文库基因文库 （gene library）基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNA文库）文库） 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因分别含有这种生物的不同的基因,称为基因称为基因文库文库(gene library)（1）从基因文库中获取目的基因）从基因文库中获

7、取目的基因基因组文库基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基基因文库中包含了一种生物所有的基因因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系 如果用某种生物发育的某个时期的如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补反转录产生的多种互补DNA（也叫也叫cDNA）片片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么

8、，这个受体菌群体就构成了这种生物的那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库文库。这种方法称。这种方法称反转录法反转录法cDNAcDNA文库的构建文库的构建（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术，可。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。PCR技术技术 原理：原理： 前提：前提： 原料原料 方式方式PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增

9、， 即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板模板DNA；DNA引物；四种脱氧引物；四种脱氧核苷酸；热稳定核苷酸；热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；离子酶）；离子n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性变性退火退火延伸延伸v（3） 人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序

10、列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同种同种1.1.过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可

11、作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？以完成任务吗？为什么？3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的末端位于基因的末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。（一）转化：（一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞

12、内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）（二）方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点： 易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感

13、染能力物没有感染能力原理：原理： TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并

14、表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管通道进入受助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体（将基因

15、表达载体提纯，用显微仪注射到提纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）（2 2）操作程序）操作程序: :提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导

16、入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？处理受体细胞？用用CaCa2 2处理，增加细菌细胞膜的通透性处理，增加细菌细胞膜的通透性四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 分子水平分子水平检测检测 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否转录是否转录 是否翻译是否翻译 个体生物学水平检测个体生物学水平检测鉴定鉴定1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2

17、2）过程）过程: : 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记, ,以此做以此做探针探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示若显示出出杂交带杂交带, ,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化

18、学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。（二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交过程过程: :用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？

19、没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基目的基因表达因表达类型类型步步骤骤检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分子分子检检测测第第一一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第第二二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第第三三步步目的基因是否

20、翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个体个体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。对位训练对位训练1.1.下列有关基因工程技术的叙述下列有关基因工程技术的叙述, ,正确的是（正确的是（ ） A.A.重组重组DNADNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶技术所用的工具酶是限制酶、连接酶 和载体和载体 B.B.所有的限制酶都只能识

21、别同一种特定的核苷酸所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸 序列序列 C.C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌 繁殖快繁殖快 D.D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达只要目的基因进入受体细胞就能实现表达C2.2.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所 需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了 在受体细胞中表达的是在受体细胞中表达的是（ ） A A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因

22、及其大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAmRNA C C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNADNA序列序列 D D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D3 3、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNADNA分子片段为分子片段为ATGTGATGTGTACACTACAC，要使其数量增多，可用，要使其数量增多，可用PCRPCR技术进行人工复制，技术进行人工复制，复制时应给予的条件是复制时应给予的条件是 双链双链DNADNA分子为模板分子为模板 ATGTGATGTG或或TACACTACAC模板链模板链 四

23、种脱氧四种脱氧核苷酸核苷酸 四种核苷酸四种核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 热稳定热稳定DNADNA聚合酶引聚合酶引物物 温度变化温度变化 恒温恒温A A B BC C D DD4、（多选）一个基因表达载体的构建应包括（多选）一个基因表达载体的构建应包括A A目的基因目的基因 B B启动子启动子 C C终止子终止子 D D标记基因标记基因ABCD5、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起聚合酶识别和结合的部位，是起始密码始密码B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对短片

24、段，对mRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别而有所差别A6、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是骤是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表目

25、的基因的检测和表达达C 例例1 1 （0808年全国卷理综年全国卷理综1 1）4.4.已知某种限制性内切已知某种限制性内切酶在一线性酶在一线性DNADNA分子上有分子上有3 3个酶切位点，如图中箭头所指，如个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性果该线性DNADNA分子在分子在3 3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a a、b b、c c、d d四种不同长度的四种不同长度的DNADNA片段。片段。 现在多个上述线性现在多个上述线性DNADNA分子，若在每个分子，若在每个DNADNA分子上至少有分子上至少有1 1个酶切个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后

26、，这些线性位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNADNA分子最多能产生长度不同的分子最多能产生长度不同的DNADNA片段种类数是片段种类数是 A.3 B.4 C.9 D. 12A.3 B.4 C.9 D. 12 答案：答案：C C 2(高考试题：高考试题：2007全国理综全国理综II)下列有关基下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是因工程中限制内切酶的描术，错误的是 A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列 B.限制性内切酶的活性受温度的影响限制性内切酶的活性受温度的影响 C.限制性内切酶能别和切割限制性内切酶能

27、别和切割RNA D、限制性内切酶可从原核生物中提取、限制性内切酶可从原核生物中提取3 3、【生物现代生物技术专题生物现代生物技术专题】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。新品系。（1 1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNADNA分子所用的限制性内切酶分子所用的限制性内切酶作用于图中的作用于图中的 处，处，DNADNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”a”或或“b”b”）（2

28、 2） 将重组将重组DNADNA分子导入水稻分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和化法和 法。法。（3 3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是技术。该技术的核心是 。（4 4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，作探针进行分子杂交检测，又要用又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织植物组织培养培养去分化和再分化去分化和再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）一定