产生过氧化氢的乳酸杆菌抑制淋球菌生长物质的初步鉴定sup△sup

1、产生过氧化氢的乳酸杆菌抑制淋球菌生长物质的初步鉴定sup>a</sup>中国医学科学学院学报1999年第21卷第5期 郑和义#曹经江晋红中王家璧摘耍目的研究产生过氧化氢的乳酸杆菌抑制淋球菌 牛长的作用机制。方法将产牛过氧化氢的乳酸杆菌与淋球菌在 体外混合培养并将其超声裂解，然后通过各种不同分子量可通过 的滤过膜滤过，收集分离的不同分子量蛋白成分，分别测定其对 淋球菌过氧化氢酶的影响。结果产生过氧化氢的乳酸杆菌在 ph5. 0情况下对淋球菌过氧化氢酶活性有明显的抑制作用，其裂 解物也能有效抑制淋球菌过氧化氢酶活性。该裂解物加热100°c 15 min后仍具备以上抑制作

2、用，但经蛋白酶k处理抑制作用丧 失。结论产生过氧化氢的乳酸杆菌能产生淋球菌过氧化氢酶的 抑制物质，通过对这种酶的抑制，进而抑制淋球菌的生长。关键词：过氧化氢乳酸杆菌淋球菌近年来有关人体内正常菌群对致病菌影响作用的研究日益 受到重视，使用生物性制剂，如乳酸杆菌、双歧杆菌等防治某些 感染性疾病的研究已有较多报告，然而女性阴道内止常菌群对获 得淋球菌感染的影响研究较少。乳酸杆菌，特别是产生过氧化氢 的乳酸杆菌(lb+)是控制和维持女性阴道内环境的主要微生物 1。有研究表明阴道内有抑制性乳酸杆菌存在的妇女比阴道内 缺乏抑制性乳酸杆菌的妇女与淋病性伴侣接触后更不容易感染 上淋病2,提示乳酸杆菌能抑制淋球

3、菌的生长，但其作用机制 尚不清楚。笔者以往的研究发现产生过氧化氢的乳酸杆菌可以通 过酸化环境，产生过氧化氢而抑制淋球菌生长3。本实验进一 步研究产生过氧化氢的乳酸杆菌是否产生一种抑制淋球菌生长 物质，进而抑制淋球菌过氧化氢酶而抑制淋球菌的生长。1材料和方法试剂 tetramethylbenzidine(tmb) 、 bovine liver catalase, horseradish peroxidine (hrp), bsa, h202 等均购自美 国sigma公司。细菌菌株的来源和生长条件 淋球菌fa1090和28bl(过氧 化氢酶阳性)及2820(过氧化氢酶阴性)菌株均来源于美国nih与

4、 北卡罗莱纳大学医学院合作性病研究屮心实验室。淋球菌的生长 按笔者以往描述的方法进行41乳酸杆菌(atcc4356和7469) 以及从正常成人女性阴道内分离经常规方法鉴定的乳酸杆菌在 乳酸杆菌mrs琼脂培养基生长(美国dlfco公司提供)。两种细 菌浓度测定用分光光度计，以菌落形成单位(cfu)表示。产生过氧化氢乳酸杆菌的鉴定 按照mcgroarty 5方法 筛选乳酸杆菌是否产生h202,将乳酸杆菌置于含有0. 25 mg/ml tmb、0. 01 mg/ml hrp> 5 mg/ml hemin 及 1 mg/ml 维生素 ki 的 乳酸杆菌mrs琼脂培养基上，在37°c、5

5、%c02条件下生长23 d, 产生h202的乳酸杆菌菌落将变为蓝色，这是由于有h202存在， hrp能将tmb氧化形成蓝色氧化产物，而不产生h202的乳酸杆 菌菌落仍为白色。乳酸杆菌对淋球菌过氧化氢酶活性实验 按1 ： 1比例将乳 酸杆菌和淋球菌(均为5x107cfu)混合在lml 0. 1%bsa的hank's平衡盐溶液(ph7. 3)中，将两种细菌混合液在37°c、5%c02、摇 荡的环境下共同培养1 h,而后测定淋球菌过氧化氢酶活性。过氧化氢酶活性根据在分光尤度计a240时消耗h202的量测定6, 一个单位的过氧化氢酶活性代表在室温25°c情况下消耗1 mmo

6、lh202/min,由于乳酸杆菌缺乏过氧化氢酶，因此在乳酸杆菌和淋 球菌混合液中所测定的过氧化氢酶活性均代表淋球菌过氧化氢 酶活性。乳酸杆菌裂解物的制备及其对淋球菌部分纯化过氧化氢酶 活性实验 将1升在lb mrs培养液37°c、5%c02下生长6 h的 lb+和lb-离心沉淀,在sonic dismembrator超声裂解30 s,然 后在冰盒中冷却30 s,再次超声裂解，重复3次，离心，收集 上清液并浓缩，透析备用；同时将lb+裂解物用80%硫酸鞍沉淀其蛋白，溶解于50 mmol/l醋酸钠溶液(ph5. 0),通过各种不同 分子量，如 300 000、100000、50 000、

7、30 000、10 000 可通过 的滤过膜滤过，收集分离的不同分子量的蛋白成分，分别测定其 对部分纯化淋球菌过氧化氢酶的抑制作用。用columchromtography方法部分纯化淋球菌过氧化氢酶4,将lb的裂解物与淋球菌部分纯化过氧化氢酶,在 ph50、37°c孵育 24 h,比较孵育前后淋球菌过氧化氢酶活性。将lb+裂解物加热100°c,15 min或用25 mg/ml蛋白酶k处理1 h,再作用淋球菌部分纯 化过氧化氢酶，测定其活性改变。2结果根据mcgroarty方法测定出乳酸杆菌4356及从正常成人女 性阴道内分离的乳酸杆菌为lb+,而乳酸杆菌7469为lb-o应

8、用 7-轻-6甲氧香豆素氧化方法测定出lb+产生h202的量为3 nm(107 cfu)。产生和不产生ii202的乳酸杆菌在不同pll值吋对 淋球菌过氧化氢酶的影响有明显不同，两者在ph值7.0时，对 淋球菌过氧化氢酶均无明显影响，过氧化氢酶活性分别为(8. 8 ±1.2)和(7. 9±0. 8)u/cfux107,与对照组(7. 2±1. 0)u/cfux 107比较差异均无显著意义(p>0. 05) o产生h202的乳酸杆菌在 ph值5.0时，对淋球菌过氧化氢酶有明显的抑制作用；过氧化 氢酶活性分别为(1.8±0. 6)u/cfux 107,与

9、对照组的(7. 4 ± 1.5)u/cfux107比较差异有显著意义(p<0. 01)；而不产生h202 的乳酸杆菌对淋球菌过氧化氢酶则无明显的抑制作用，过氧化氢 酶活性分别为(5. 8±1. 4)u/cfux 107,与对照组比较差异无显著 意义(p>0. 05) o lb+和lb-裂解物中仅lb+在ph5. 0时能抑制部 分纯化的淋球菌过氧化氢酶活性，而ph5. 0对淋球菌过氧化氢酶 活性无影响；lb+裂解物加热100°c15 min后仍然有抑制作用， 而经蛋白酶k处理后抑制作用丧失(附表)。lb+裂解物通过不同 分子量滤过膜滤过分离，发现分子量约

10、1000030 000的裂解物 对淋球菌过氧化氢酶活性抑制作用最明显，分子量30000100 000的裂解物也有轻度抑制作用(附表)o附表 产生和不产生h202的乳酸杆菌裂解物在ph5. 0时对部分 纯化的淋球菌过氧化氢酶的抑制作用table effects of lysates of h202-producing(lb+) and nonproducing (lb-)lactobacilli on partly purified gonococcal catalase activity at ph 5 0catalase activity(units/mg protein)pcontrol5

11、 349+157 lb+3 241±286<0. 01lb-5 437±198>0. 05lb+ (heat-treated)3 599 ± 117 < 0. 01lb+(proteinase k-treated)5 635 ± 287 > 0. 05lb+(mr<10 000) 5 236±220>0. 05lb+(mrl0 00030 000)2 682 ± 186 < 0. 01lb+(mr30 000 50 000)4 208 ± 218 < 0. 05lb+(mr50

12、 000100 000)4 035±204<0. 05lb+(mrl00 000 300 000) 5 421 + 226>0. 05 mr:relative molecular mass3 讨论淋球菌是以感染人为唯一宿主且侵犯粘膜的病原菌，其感染 毒力受多种因素影响，其中过氧化氢酶的含量是一个重耍因素。 通常绝大数细菌通过过氧化氢酶和过氧化物歧化酶(sod)共同抵 抗各种氧化物的毒性作用，而淋球菌则缺乏过氧化物歧化酶7, 仅表现出高浓度的过氧化氢酶8。缺乏过氧化氢酶的淋球菌的 毒力明显减弱，并且很容易被人体中性白细胞所杀灭4,9。笔 者先前的研究表明乳酸杆菌能抑制淋球菌

13、生长，对过氧化氢酶阴 性的淋球菌的抑制作用明显大于对过氧化氢酶阳性淋球菌的抑 制作用3。本研究发现产生过氧化氢的乳酸杆菌能产生一种抑 制物质，在ph5.0情况下具有抑制淋球菌过氧化氢酶的作用；通 过对过氧化氢酶的抑制，进而抑制淋球菌的生长。产生过氧化氢 的乳酸杆菌产生的能抑制淋球菌过氧化氢酶作用的物质的性质 目前还不清楚，文献上也未见报道，其特征类似细菌素样物质， 据报道乳酸杆菌能产生细菌素b和f 10, 11,但这两种细菌 素仅对其它乳酸杆菌菌株有损害作用，且细菌素f的分了量为 2500,而本研究发现的抑制物质的分子量约10 00030 000,耐热，提示其既不是细菌素，也不是酸性蛋白酶，因

14、为后者不耐 热。本研究发现的抑制物质经蛋白酶k处理后活性丧失，有可能 是一种新的蛋白抑制因子。综合笔者以往的研究，认为产生过氧 化氢的乳酸杆菌可能通过酸化环境，即降低ph值，产生过氧化 氢和抑制淋球菌生长物质而抑制淋球菌的生长。作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院 皮肤科,北京100730参考文献1 klebanoff sj, hillier sl, eschenbach da, et al. control of microbial flora of vajina by 11202-generating lactobacilli. j infect dis, 1991, 16

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