人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定（医学论文）

1、人突变cd59的表达.纯化及抗原性鉴定【摘要】目的获得纯化人突变cd59(hmcd59)蛋白， 制备其特异性抗体，对纯化产物进行鉴定。方法将含有hmcd59 全长序列的重组palter质粒，运用脂质体介导法转染cho细胞, 采用sds page检测hmcd59的表达情况，表达产物经antiflag m2 affinity gel纯化后制备抗血清，以此抗血清鉴定纯化产物。结果hmcd59在cho细胞获得表达,anti flag m2affinity gel纯化后可获得电泳纯的hmcd59蛋白，hmcd59与小鼠抗hmcd59抗血清具有特异性反应。结论 从真核细胞获得了 电泳纯并具有抗原性的hmc

2、d59蛋白，为进一步对其进行抗体制备、 功能研究及临床应用奠定了基础。【关键词】人突变cd59真核细胞表达纯化 抗原性abstract objectiveto obtain purified human mutantcd59 (hmcd59) protein and to identify the purified product with specific antiserum against hmcd59 protei n methodsthe recombinant palter plasmid containing hmcd59 cdna was transfected into cho

3、 cells with pcdna3 by lipofectamine expression of hmcd59 oncho cells was detected by sds page the recombinant protein was purified by anti flag m2 a伍nity gel. the antiserum was prepared with the purified hmcd59 and used to identify the purified hmcd59.resultshmcd59 protein was purified by anti flag

4、m2 affinity gel. furthermore, hmcd59 had specific reactivity with mouse anti hmcd59 antiserum.conclusionthe purified hmcd59 protein has been obtained successfully, which lays the foundation for preparing antibody, further functional study and clinical application of hmcd59key words human mutant cd59

5、; eukaryotic cellsexpression; purification ； antigenicitycd59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚固膜蛋白，相对分子质量较小，只有20 000左右，在补体活化通路的不同阶段限制补体活化，成为攻膜复合体(mac)形成的关键抑制 物，从而保护自身正常的组织细胞免受补体损伤elo国内外研究显 示，人cd59糖化后失去抑制mac的功能2,突变人 cd59(hmcd59)在高糖环境下更加易于糖化失活,抗补体活性更快降低3, mac沉积增加，内皮释放生长因子，引发糖尿病病人血管增殖4。人类糖尿病血管并发症发生的潜在机制仍然不十

6、分清 楚，尤其是hmcd59与糖尿病并发症的相关性鲜有报道。本研究报 道hmcd59蛋白的表达、提取、纯化及抗原性鉴定，为下一步制备抗hmcd59单克隆抗体并对其进行临床应用研究奠定基础。1材料和方法1.1材料1.1.1质粒、菌株与细胞株 质粒hmcd59 palter由本室构建保存。pcdna3由美国哈佛大学提供。cho细胞株由本室保存。1.1.2主要试剂ecor i购自宝生物大连有限公司。rpmi 1640培养基购自hyclone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有 限公司产品。g418选择性抗生素购自于amresco公司。lipofectaminetm2000 为 invitroge

7、n 公司产品oanti flag m2 affinity gel freezer safe 为 sigma aldrich 公司 产品。vivaspin 2超滤浓缩离心管为sartorius公司产品。弗氏完全佐剂、 弗氏不完全佐剂均为sigma公司产品。hrp标记的羊抗小鼠igg为 北京中山生物技术有限公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。1.2实验方法1.2.1 质粒 hmcd59 palter 的鉴定 将hmcd59 palter质粒经ecor i酶切鉴定并经上海生物工程公司测序确认。1.2.2 hmcd59在cho细胞中的表达重组质粒hmcd59palter 对 cho 细胞的转染，参

8、照 lipofectaminetm2000的说明书进行。转染后24 h将细胞作1 : 10稀释后传代,48 h后加入选择培养液(含有800 mg/l的g418)筛选阳性克隆2周，挑取单个克隆,继续抗性筛选2周，其阳性克隆的后续培养始终在g418 维持剂量(400 mg/l)下进行。收集生长状态良好的阳性cho细胞,裂解后离心取上清以sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds page)鉴定蛋白的表达。1.2.3目的蛋白hmcd59的纯化 获取生长良好的107-108个 转染cho细胞，加入细胞裂解液(含50 mmol/l tris hcl,ph 7.4, 150 mmol/l nacl, 1 mmol/

9、l edta，体积分数 0.01 的 tritonx 100)10 ml,冰上振荡裂解30 min后低温离心取上清 待用。将anti flag m2 affinity gel装柱并静置，待填料完全 沉降后，用 tes (其中含 50 mmol/l tris hc1,15o mmol/l nacl, ph 7.4)冲洗,连续加3次柱体积的0.1 mol/l甘氨酸hc1 (ph 3.5) 洗胶，再以tes在4 c平衡树脂。加入总蛋白提取物，在重力作用 下多次流经亲和柱，保持4 9,控制流量为1 ml/min,再用10 20个柱容积的tes冲洗，去掉未结合的杂蛋白，经磺硫酸检测无蛋 白流出。然后用6

10、个1 nil的0.1 mol/l甘氨酸hc1 (ph 3.5)进行 洗脱，分别收集入6个含有20 yl 1.0 mol/ltris (ph &0)的管中。1.2.4 hmcd59 的 sds page 鉴定 sds page 中使用 120 g/l的分离胶和50 g/l的浓缩胶。将收集的洗脱峰蛋白2 ml装入 vivaspin 2超滤浓缩离心管中，3 000 r/min离心12 min进行浓 缩至浓度为1 g/l。取20 ml浓缩后样品与等体积2 x上样缓冲液混 匀后，在沸水浴中加热5 min,上样，起始电压为70 v。当样品移岀 浓缩胶与分离胶的分界处时，加大电压到100 v至电泳终

11、了，经考 马斯亮蓝染色后观察结果。1.2.5小鼠抗hmcd59抗血清的制备 将hmcd59与等体积弗 氏完全佐剂制成乳化剂，以10 ug剂量多点注射于2只68周龄雌 性balb/c小鼠的背部，21 d后以同样剂量的hmcd59与弗氏不完全佐剂乳化进行第一次加强免疫，背部皮下多点注射，14 d后以同样方法进行第2次加强免疫。10 d后断尾采血制备抗血清。将 hmcd59蛋白进行稀释（2、10 mg/l）后包被，均设3个复孔。以酶联免疫吸附试验（elisa）测定抗血清的效价，免疫前小鼠血清 作为阴性对照。2结果2.1质粒hmcd59 palter的鉴定以ecor i对hmcd59 palter进行

12、酶切，获得1条496 bp 的电泳带,与插入的目的基因片段大小相一致（图do测序结果表明, hmcd59 palter59含有突变的cd59全长cdna序列。2.2目的蛋白hmcd59的表达已转染hmcd59 palter的cho细胞sds page分析显 示，在相对分子质量为20 000处出现条带（图2）,同预期结果一致。2.3目的蛋白hmcd59的纯化将转染cho细胞总蛋白提取物经过anti flag m2 affinity gel亲和层析纯化，收集洗脱液，浓缩后经sds page并用考马 斯亮蓝染色显示，得到电泳纯hmcd59蛋白（图3）。2.4抗hmcd59抗血清的制备及鉴定以纯化的h

13、mcd59为免疫原，免疫2只balb/c小鼠，在2 次加强免疫后取血制备抗血清，2只小鼠的抗血清效价均在1 : 10 000以上，免疫前血清与hmcd59无特异性反应，表明获得了抗hmcd59的抗血清。糖尿病血管增殖症是严重危害糖尿病病人的并发症，明确糖尿病 血管增殖症的发病机制并有效防治,是目前糖尿病诊断及治疗领域中 的重点。研究证实，cd59作为一种补体调节蛋白，可阻止mac形 成，对于保护自身细胞免受补体损伤起到了关键的作用5,6。对cd59结构及功能的研究揭示，人类cd59分子存在易于糖基化位 点k41h44 7,糖化人cd59失去了 mac的抑制功能2。近年来，有研究表明，人cd59

14、糖基化位点突变后在高糖环境下更 加易于糖基化而失去抗补体活性3,致使mac大量沉积于血管内 皮，促使血管内皮释放成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子, 刺激成纤维细胞、平滑肌细胞过度增殖，从而发生血管增殖症及硬化 症4。因此，有学者推测糖尿病病人体内存在cd59基因突变，但目前国内外尚无能够用于检测抗hmcd59的抗体，hmcd59的提取、纯化及鉴定国内外也尚未见报道。本实验将重组的hmcd59palter质粒转染cho细胞，长期实验及鉴定表明,hmcd59可以在cho细胞稳定表达。通过培养表达hmcd59的cho细胞，并将其总蛋白提取物用亲和 层析法进行纯化，经鉴定表明得到了电泳纯的hmc

15、d59蛋白。本研 究设计具有以下特点：选用cho这种低表达非特异性蛋白的哺乳 动物细胞系用来进行重组质粒的转染，保证了特异性目的蛋白稳定表 达。采用 sigma aldrich 公司的 anti flag m2 affinity gel 进行纯化，国内尚无报道。本产品通过氢键将纯化的单克隆抗体共价 结合在琼脂糖上，可用于flag融合蛋白的纯化，其结合flag肽 是非钙依赖性的oanti flag m2 affinity gel具有手工操作方便、 化学物理稳定性强、可再生重复利用、特异性强、回收率高等优点， 由于本实验中hmcd59 palter重组质粒设计含有flag序列,利用细胞表达flag

16、与亲和胶抗flag单克隆抗体特异性结合可获 得高纯度的flag融合蛋白。以纯化的hmcd59为免疫原制备了 高效价的抗血清，说明获得的hmcd59具有较强的抗原性。鉴于hmcd59在人类糖尿病血管并发症发生及诊断中的重要性，本文获得了电泳纯的hmcd59蛋白及其抗血清，为下一步制备其单克隆抗 体，进一步明确人突变cd59与人类糖尿病血管并发症之间的分子 机制、潜在关系及临床糖尿病的诊断奠定了坚实的基础。【参考文献】1 xuebin q, allison g, nicole k, et al. glycation inactivation of the complement regulatory

17、 protein cd59: a possible role in the pathogenesis of the vascular complications of human diabetes j diabetes,2004,53(10):2653 2661.2 juan a, judith h, rudolf f, et al. molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes j pnas, 2000,97:54505455.3张艳丽，高美华.人cd59基因的

18、突变和表达及其活性研究j2005, 21 (2): 151154.4 benzzaquen l r, nicholson weller a, halperin j a. terminal complement proteins c5b 9 release basic fibroblast growth factor and platelet derived growth factor from endothelial cells j j exp med, 1994,179:985 992.5 qin x, krumrei n, grubissich l, et al. deficiency of the mouse complement regulatory protein mcd59b results in spontaneous hemolytic anemia with platelet activation and progressive male infertility j immunity, 2003,18:217 227.6 brooimans r a. relative roles of decay accelerating factor, membrane cofactor protein, and cd59 in the protection of hu