基因工程2—工具酶(中国药科大学生物工程所有课件)

1、基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶赖一些酶( (如限制性核酸内切酶，连接酶，如限制性核酸内切酶，连接酶，DNADNA聚聚合酶等合酶等) )作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶工具酶”。工。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。造、优化、而产生的生物工程产品。自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢参与微生物的核酸代谢，在

2、核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的区别自己和非己的DNADNA进而降解非己进而降解非己DNADNA的防御工具的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。基因工程工具酶基因

3、工程工具酶 限制性内切酶 连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶一、细菌的限制一、细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现修饰作用和限制性内切酶的发现第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶5050年代后年代后LuriaLuria和和Human(1952) BertaniHuman(1952) Bertani和和Weigle(1953)Weigle(1953)发现细菌的发现细菌的“限制限制”现象现象. .1 1、细胞的限制、细胞的限制修饰作用修饰作用Phage（k）感染感染E.coli k不感染不感染E .coli B (E .coli B 限制限制 （

4、k）)仍有少量仍有少量(K)可在可在 E.coli B中生存，是因中生存，是因 E.coli B对对(K)进进行了修饰。行了修饰。E.coli B修饰修饰(k)*(k)感染感染E.coli(B)细菌如何对细菌如何对噬菌体进行限制和修饰？噬菌体进行限制和修饰？1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。 1965年，Arber发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制限制修饰系统修饰系统(R-M Restriction-modification system)。R-M系统是细菌安内御外

5、的积极措施。细菌的限制细菌的限制修饰系统修饰系统n即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-M systemn限制性内切酶识别特异的限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。使得限制性内切酶无法识别。n这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。在甲基

6、化酶的作用下被保护起来。细菌的限制和修饰现象细菌的限制和修饰现象 1968年年Linn和和Arber从从E.coli B中发现限制中发现限制酶酶,M.Meselson和和R.yuan从从E.coli K中分离到另一限中分离到另一限制性的内切酶。制性的内切酶。 1970年年Smith (美美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶酶即限制酶。 限制酶的功能：降解不同源限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源，而不降解同源DNA。 1978年年W.Arber、H.O.Smith(美美)，Nathans(美美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获因发现限制性内

7、切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。得诺贝尔奖。限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现二、限制性核酸内切酶二、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列（48bp），），并由此处切割切割DNA双链双链的核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）2.2.性质性质内切酶。内切酶。原核生物。原核生物。即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。自我保护作用。自我保护作用。3. 3. 功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）1. 1. 来源来源限制性内切酶将侵入细菌体内

8、的限制性内切酶将侵入细菌体内的外外源源DNADNA切成小片断。切成小片断。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction）细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。酶识别切割。（2）修饰（）修饰（Modification） Dam甲基化酶甲基化酶(Mec甲基化酶甲基化酶)GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基1973年年H.O Smith和和D. N

9、athans提议的提议的命名系统，命名原则如下：命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名1.用属名属名的第一个字母和种名种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌寄主菌的物种名。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。4. 限制酶前面要带上限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上修饰酶前面要带上M（Modification）。）。（现已省略）。（现已省略）。2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型菌株或型。如如E

10、cok, EcoR（现在都写成平行，如（现在都写成平行，如EcoRI）。）。3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。的限制与修复系统，用罗马字母表示。如如EcoR I，EcoR V。EcoR IEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2个字母相同则其中一个可用个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。种名的第一和第三个字母。I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。四、限制性内切酶的类型四、限制性内切酶的类型I

11、I 类限制性内切酶类限制性内切酶 III类限制性内切酶类限制性内切酶 首先由首先由M. Meselson和和R. Yuan在在1968年年从大肠杆菌从大肠杆菌 B株株和和 K株株分离的。分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. I类限制性内切酶类限制性内切酶 如如 EcoB和和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列，非对称性。未甲基化修饰的特异序列，非对称性。需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理）作用机理在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开

12、一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点）切割位点首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。2.II类限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组及分子生物学实验中被广泛使用。 （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA；四、五或六个碱基对，而且具有180旋转对称的回文结构。与DNA的来源无关。II类酶分类（2 2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNADNA。形成。形成粘

13、性末端粘性末端（sticky sticky endend）或）或平齐末端平齐末端（blunt endblunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。 （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链突出的末端。分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG5-33-55-33-5CTGCAG 3端凸出（如Pst I切点）GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC 连接便利（4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连

14、接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。 补平成平齐末端凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers) 完全同裂酶(同位酶)：识别位点和切点完全相同。如Hind 和Hsu I。识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等（

15、6）同尾酶(Isocaudamers） Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的同尾酶的粘性末端互相结合后形成的“杂种位点杂种位点”一般不能一般不能再被原来的酶识再被原来的酶识别。别。？Sau 3A限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。（7）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性 星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。EcoR I和BamH I等都有*活性,使用时要注意！在低盐、高

16、pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：如： ECORI识别特异性放宽，GAATTCAATT导致星号活性的因素 以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。 在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（8）s型限制性内切酶移动切割（shifted cleavage):533. III类限制性内切酶类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA，但反应，但反应需要需要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨腺苷蛋氨酸）。酸）。在基因工程

17、操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。五、影响限制性内切酶活性的因素 1、底物 DNA1) DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。 2) DNA浓度 DNA过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。 如：4g DNA /1U HPa 50l 在37下 15h 而 1g DNA /1U HPa 50l 在37下 1h 3） 识别位点及邻近位点特异性序列 由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如： DNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。 pBR322 DNA 有4个Nar切点

18、(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。 Xma切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割 4) DNA二级/三级结构 超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。 5) 提取时混入杂质可改变识别特异性 如： 高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65

19、 oC。3. 温度 是影响限制酶活性的重要因素。4. 缓冲液(Buffer) （1）缓冲液的化学组成金属离子 如型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如Hind，ECORI）则特异性改变。 离子浓度，合适激发酶活；不合适抑制酶活。 牛血清蛋白(BSA)MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl： 维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65/5min除去。 水无离子水，ddH2O，

20、双蒸水。无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近buffer商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。六、限制性内切酶对六、限制性内切酶对DNADNA的消化的消化1. 1. 内切酶与识别序列的结合模式内切酶与识别序列的结合模式 1986年年J.A. McClarin等通过等通过X射线晶体射线晶体衍射发现衍射发现II类限制酶是以类限制酶是以同型二聚体同型二聚体的的形式与靶序列结合。形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG内切酶在内切酶在DNADNA上的上的所有所有识别位点都被切开。识别位点都被切开。2. 2. 完全消化完全消化 12 341234只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位

21、点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。少酶的用量可达到局部消化的目的。3. 3. 局部消化局部消化 12 3414大多数酶可用大多数酶可用65 65 o oC C温育温育5 5分钟失活。分钟失活。或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNADNA。4. 4. 限制酶酶切反应的终止限制酶酶切反应的终止 5. 5. 几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点 6. 6. 双酶切双酶切双酶切注意事项双酶切注意事项 选活性至少都在选活性至少都在8080以上的以上的bufferbuffer 注意反应温度注意反应温度 1 1）温度一致时可同时进行

22、）温度一致时可同时进行 2 2）温度不一致时，先切温度低的，再切）温度不一致时，先切温度低的，再切温度高的温度高的先切一个，回先切一个，回收后再切另一个收后再切另一个. .从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节 DNA 连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。（1 1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1. 1. 两种两种DNADNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端。粘性末端。分子量分子量74000dal,74000dal,辅因子辅因子NAD+,NAD+,其作用是封其作用是封闭双螺旋骨架上具有闭双螺旋骨架上具有5-5-磷酰基和磷

23、酰基和3-3-羟基的缺口，形成磷酸羟基的缺口，形成磷酸二酯键。二酯键。二、二、DNA ligaseDNA ligase的特点的特点（2 2）T4T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶T4DNA连接酶来自于连接酶来自于T4噬菌体感染的噬菌体感染的E.coli，为，为T4噬菌噬菌体自身的表达产物。分子量体自身的表达产物。分子量6.8万万dal，辅因子位，辅因子位ATP，该，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中： NAD+2. 连接

24、条件1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3. AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ + +H3NAMPATPPPi4. AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。 具体做法是，在体外将具有粘性末端的DNA限制片断，

25、插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。粘性末端粘性末端DNADNA片段的连接（连接酶的作用）片段的连接（连接酶的作用）5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG用粘性末端构建重组体用粘性末端构建重组体DNADNA的最主要缺点：的最主要缺点：

26、1、无法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，经连接酶作用，形成共价闭环的稳定环形结构。克服该缺点的方法是，用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去末端的5磷酸基团，于是在连接反应中，它自身的两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接起来了。1 1、同聚物加尾法、同聚物加尾法 是由美国斯坦福大学的P.Labban和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3-OH上。如果

27、在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度一般1040个残基。 平末端平末端DNADNA片段的连接片段的连接缺点： 插入的片段难以回收。 无法控制外源基因插入方向。 用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.C 3 GG5 G 3C5C3GGTTTTTTTTTT 3CC3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGCTG

28、CA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACG

29、TCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 55GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATT

30、CCCTAGGGGGGGTTAAG衔接物（衔接物（linker)linker)连接法连接法所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。将衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。优点：克隆后还可回收原插入片断。 DNA DNA衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显的的缺点缺点是，如果待克隆的是，如果待克隆的DNADNA片段或基因

31、的内部也含片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。麻烦。DNADNA接头接头(adaptor)(adaptor)连接法连接法DNADNA接头接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。头为平末端

32、的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。问题：各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5-OH所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在5-OH和3 OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度四、连接反应的温度1. 最佳温度最佳温度但在但在3

33、7下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2. 实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 C。增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1. 1. 插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 2. 2. 反应温度反应温度五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素10201020倍。倍。一般一般14161416第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.DNA聚合酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)2.Klenow fragment (E.coli)3.

34、TDNA聚合酶聚合酶(TPhage感染的感染的E.coli)4.TDNA聚合酶聚合酶(TPhage感染的感染的E.coli)5.修饰的修饰的TDNA聚合酶聚合酶(测序酶测序酶) 6.DNA末端转移酶末端转移酶(小牛胸腺小牛胸腺)7.反转录酶反转录酶(依赖依赖RNA)聚合酶聚合酶1. 共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端。端。2. 主要区别主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从

35、模板上解离下来。二、常用的二、常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。高高快快无无无无遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶高高3. 常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较三、三、DNA聚合酶在基因工程中的用途聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的端的部分。就成为部分。就成为Klenow

36、fragment。 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应条件）的反应条件-OH53dNTPs标记标记能够同某种被研究的核酸序列特异能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带

37、有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断53切口转移法切口转移法(nick translation )： 放射性同位素标记：放射性同位素标记：DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活性活性和和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外切外切酶活性）。酶活性）。53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的的上一段上一段DNA的的3一侧补上一个新的核苷酸。一侧补上一个新的核苷酸。切口切口切口切口55335353纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制制造

38、单链切口造单链切口DNA Pol I 进行进行切口转移切口转移一种一种a-32P-dNTP和和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记8具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活性。外切酶活性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性质的性质C 端端76，000 dKlenow活性活性 聚合聚合 5外切外切N 端端36，000 5外切外切 Jacobsen(1974),Joyce 和和 Grindley,(1983)克隆此克隆此大片段。大片段。DNA Pol I 枯草杆菌枯草杆

39、菌蛋白酶蛋白酶 3 3端补平端补平5555klenowklenow补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的33隐蔽端隐蔽端。在在33隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTPdNTP。klenowklenow（2 2）主要用途）主要用途33隐蔽末端的隐蔽末端的DNADNA片断片断KlenowKlenow fragment fragment补平补平根据末端的顺序选根据末端的顺序选择一种择一种 a-a-3232P-P-dNTPsdNTPs末端标记的末端标记的DNADNA限制性内切酶切限制性内切酶切5-G35-G33-CTTAA53-CTTAA55-G5-GAAAA333-CT

40、TAA53-CTTAA55-G5-GAAAATT3TT33-CTTAA53-CTTAA55-G35-G33-CCTAG53-CCTAG55-G5-GG G333-CCTAG53-CCTAG55-G5-GG GATC3ATC33-CCTAG53-CCTAG5EcoREcoR I IBamHBamH I Ia-a-3232P-dATPP-dATPa-a-3232P-dGTPP-dGTP2525o oC 1hC 1hmRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow533553引物引物纯化的DNA片断加热变性klenow进行5-3聚合反应随机引物，一种a-32P-dNTP和dN

41、TPs5555555333333332P-dNTP32P-dNTP（1 1） T4 DNAT4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质3. T4 DNA3. T4 DNA聚合酶聚合酶从从T4T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由中分离纯化。由噬菌体基因噬菌体基因4343编码。编码。有有5533聚合酶活性和聚合酶活性和3355外切外切酶活性（降解单链更快）。酶活性（降解单链更快）。 来源来源 酶活性酶活性当没有当没有dNTPdNTP时，时，T4DNAT4DNA聚合酶行使聚合酶行使3355外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出33隐蔽端。隐蔽端。如果只有一种如果只有一种d

42、NTPdNTP，则降解到该，则降解到该dNTPdNTP的的位置。位置。55335533T4 DNA聚合酶无dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs55（2） T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端 DNA 3末端标记酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切）DNA酶切片断T4 DNA聚合酶（53聚合）55335533553355335533内切酶切无dNTPs4. T7 DNA聚合酶（

43、1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53聚合酶和35外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基： 硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。（2）T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 35外切酶活性高单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍 进行末端标记 以大分子量DNA为模板的合成如M13 补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途取代合成法标记3末端。与T4 DNA聚合酶相同。合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。5. 修饰的T7 DNA聚合酶（1）T7DN

44、A聚合酶的化学修饰去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA测序双脱氧法。 标记DNA 3隐蔽末端 更有效地补平末端来源：是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。结构：MW=60，000d.活性： 催化dNTP掺入DNA 3-OH末端，形成同聚物末端 反应不需模板DNA，需Co2+。用途： 克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。 末端标记6.末端转移酶(不依赖模板的DNA聚合酶)商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。来自鼠类白血病病毒（M

45、MLV）反转录酶。7. 逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源酶类别肽链5-3聚合活性RNaseHRNaseH：以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。合成长合成长cDNA M-MLV优于优于AMV.RNaseHRNADNARNADNA（3 3）逆转录酶的用途）逆转录酶的用途 合成合成cDNAcDNA以以oligo dToligo dT为引物（与为引物（与mRNAmRNA的的polyApolyA尾尾巴互补结合）。巴互补结合）。AAAAATTTTT53mRNA 5cDNA核酸探针核酸探针 (Nucleic acid probe)(Nucle

46、ic acid probe)1.1.放射性标记探针放射性标记探针优点：优点：灵敏度高，可以检测到灵敏度高，可以检测到pgpg级。级。 放射自显影效果好。放射自显影效果好。缺点：缺点：半衰期短（半衰期短（3232P P只有只有14.314.3天）天）不易保存、不易保存、对人体有害。对人体有害。要求在专门实验室操作。要求在专门实验室操作。2. 2. 非放射性标记探针非放射性标记探针i i）生物素标记：）生物素标记：生物素（生物素（biotinbiotin），又称维生素），又称维生素H H、辅酶、辅酶R R可以与可以与dNTPdNTP酰化结合成为生物素酰化结合成为生物素-1,6-dUTP-1,6-d

47、UTP、生物素生物素-1,4-dATP-1,4-dATP、生物素、生物素-1,1-dUTP-1,1-dUTP等。等。CHCH2 2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2 2) )4 4-COOH-COOH也可以被生物素连接酶（也可以被生物素连接酶（biotin ligasebiotin ligase）催化与蛋白质共价结合。催化与蛋白质共价结合。纯化的纯化的DNADNA片断片断DNaseDNase I I 制制造单链缺口造单链缺口DNA PolDNA Pol I I 进进行缺口转移行缺口转移生物素生物素-dTTP-dTTP和和dNTPsdNTPs55555

48、55533333333生物素生物素-dTTP生物素生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入利用缺口转移法将生物素掺入DNADNA探针中探针中光敏生物素标记光敏生物素标记生物素生物素连接臂连接臂光敏基团光敏基团探针序列探针序列探针序列探针序列生物素生物素连接臂连接臂光敏基团光敏基团+ +光照光照在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100100150150个碱基才能标记一个生

49、物素，对于短的基个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985Forster et al 1985）。）。 抗生物素蛋白（抗生物素蛋白（avidinavidin）：）：链霉抗生物素蛋白（链霉抗生物素蛋白（streptavidinstreptavidin）：）：生物素的识别生物素的识别亲和素亲和素：是一种是一种鸡鸡卵清蛋白。卵清蛋白。细菌细菌中中avidinavidin的类似物。的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：能与生物素特异结合

50、的蛋白或抗体，常用：iiii）地高辛标记：）地高辛标记：可以与可以与dNTPdNTP连接成地高辛连接成地高辛-dUTP-dUTP等，参入等，参入DNADNA合成过程。形成地高辛标记的合成过程。形成地高辛标记的DNADNA探针。探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒的试剂盒 (kit)(kit)。地高辛的结合物是地高辛的结合物是抗地高辛抗体抗地高辛抗体。常用的两种酶：常用的两种酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（h horseorser radish adish p perero oxidasexidase，HRPOHRPO）碱性磷酸酶碱性磷酸酶（A A

51、lkaline lkaline P Phosphatasehosphatase, AP, AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中催化一些特殊的反应，反应的过程中发出发出荧光荧光（或生成（或生成有色的产物有色的产物）。）。酶的作用：酶的作用：HRPOHRPO和和APAP的显色反应底物的显色反应底物碱性磷酸酶催化发光反应机理碱性磷酸酶催化发光反应机理金刚烷金刚烷 生物素生物素探针序列探针序列待测基因待测基因亲和素亲和素酶酶底物底物中间产物中间产物产物产物发光发光探针探针DNADNA用用生物素或地高辛生物素或地高辛标记。标记。亲和素或地高辛抗体与亲和素或地高辛抗体与酶酶偶联。偶联。酶酶催化一个催化一

52、个发光或显色反应发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体亲和素或地高辛抗体与与生物素或地高辛结合生物素或地高辛结合。一、一、T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1. 1. 来源来源T4T4噬菌体的噬菌体的pseTpseT基因编码。基因编码。从从T4T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 2. 功能功能催化催化g g磷酸从磷酸从ATPATP转给双链或单链转给双链或单链DNADNA或或RNARNA的的5-OH5-OH端。端。不论不论5-OH5-OH端突出与否。端突出与否。第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶5533H

53、O-HO-OH-OH5533 HO-HO-OH-OH33P-P-OH-OH5533 HO-HO-P-P55ATPATPT4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶如果如果ATPATP的的g g磷酸带有磷酸带有3232P P标记，就会被转移标记，就会被转移到到DNADNA的的55端。端。但天然的但天然的DNADNA的的55端都是磷酸化的。端都是磷酸化的。3. 3. 多核苷酸激酶的用途多核苷酸激酶的用途DNA 5-OHDNA 5-OH端磷酸化、标记端磷酸化、标记DNADNA的的55端。端。5533HO-HO-OH-OH5533 HO-HO-OH-OH333232P P- -OH-OH5533 HO-HO- -

54、3232P P55(g-(g-3232P P)ATP)ATP多核苷酸激酶多核苷酸激酶33P-P-OH-OH5533 HO-HO-P-P55碱性磷酸酶碱性磷酸酶（1 1）正向反应（）正向反应（forward reactionforward reaction）（2 2）交换反应标记法）交换反应标记法反应混合物中具有超量反应混合物中具有超量(g-(g-3232P P)ATP)ATP和和ADPADP时，时，多核苷酸激酶能催化多核苷酸激酶能催化(g-(g-3232P P)ATP)ATP的的g-g-3232P P与与DNA5DNA5端的磷酸端的磷酸交换交换。33P-P-OH-OH5533 HO-HO-P-

55、P55333232P P- -OH-OH5533 HO-HO- -3232P P55(g-(g-3232P P)ATP)ATP、ADPADP多核苷酸激酶多核苷酸激酶反应效果不理想。反应效果不理想。1. 1. 碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。B Bacterial acterial a alkaline lkaline p phosphatasehosphatase，BAPBAP（1 1）细菌性碱性磷酸酶）细菌性碱性磷酸酶（2 2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶C Calf alf i intestinal alkaline ntestinal alk

56、aline p phosphatasehosphatase，CIPCIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。具有抗热性。SDSSDS中加热中加热6868o oC C可完全失活。可完全失活。2. 2. 碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的特性催化脱掉催化脱掉DNADNA（或（或RNARNA）55端的磷酸端的磷酸根。根。33P-P-OH-OH5533 HO-HO-P-P555533HO-HO-OH-OH5533 HO-HO-OH-OH碱性磷酸酶碱性磷酸酶3. 3. 碱性磷酸酶的功能碱性磷酸酶的功能（1 1）防止线性化的载体份子自我连接）防止线性化的载体份子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端

57、容易自我连接。单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTAAGCTTTTCGAATTCGAAHindHind酶切酶切A-OHA-OHT TTCGATCGA- -P PP P- -AGCTAGCTT T HO-A HO-A碱性磷酸酶碱性磷酸酶555555A-OHTTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOHOH与与OHOH不能形成磷酸二酯键，所以不能自不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。我连接。但同一酶切后的但同一酶切后的外源外源DNADNA的的55端有端有P P，能与脱磷酸的载体能与脱磷酸的载体3OH3OH连接。连接。ATTCGAAGCTT AAGCTTAATTCGA连接酶连接酶-

58、OH与与-OH连不住连不住其中每条链上都有一个其中每条链上都有一个nicknick，但转入细，但转入细菌后会被修复。菌后会被修复。3P-AGCTTA-OH53HO-ATTCGA-P5外源外源DNA第五节第五节 RNA RNA 聚合酶聚合酶 1. 1. RNA RNA 聚合酶聚合酶T T7 7、T T3 3RNA RNA 聚合酶在聚合酶在E.coliE.coli中的克隆表达。中的克隆表达。T T7 7、T T3 3、RNA RNA 聚合酶在酵母中的克隆表达。聚合酶在酵母中的克隆表达。E.coliE.coli RNA RNA聚合酶。聚合酶。2.2.酶酶 活活DNADNA指导下的指导下的RNARNA

59、合成，结合于启动子部位。转录合成，结合于启动子部位。转录无意义链无意义链( (一一) )产生与有意义链相似产生与有意义链相似( (以以U U代替模板代替模板中中T)T)的链。的链。商品酶为商品酶为: :2 2、多聚、多聚(A)(A)聚合酶聚合酶(E.coli(E.coli) )结构：结构：MW=58000MW=58000，一条多肽链。，一条多肽链。活性：活性：催化催化RNA 3RNA 3末端加末端加AMPAMP。用途：用途：在在RNA 3RNA 3末端加末端加Poly(A)Poly(A)，以合成，以合成cDNAcDNA (Gethin (Gethin等等.1980).1980)。用用3232P

60、ATPPATP标记标记RNA 3RNA 3末端。末端。3 3、鸟苷酸转移酶、鸟苷酸转移酶(Guanylytransferase(Guanylytransferase) )来源：来源：牛痘病毒。牛痘病毒。活性：活性：催化催化GTPGTP转移转移GMPGMP至至55PPPPPPRNARNA的的 55末端。末端。55PPP-RNA + GTP PPP-RNA + GTP 或或55PPRNAPPRNA。ppippiG G55PPPPPP55NRNANRNA用途：用途：体外转录体外转录RNARNA产物加帽。产物加帽。第六节第六节 核酸外切酶（核酸外切酶（ ExonucleasesExonucleases