人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定(精)

1、人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定关键词：骨形成蛋白-7 ;克隆；序列测定中号：Q786 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03 0213 02 人骨形成蛋白？7(hBMP?7 最早由 Celeste 等1克隆并命名。同年， Ozkaynat 等2从人脑cDNA 文库中也筛选出此克隆。以后研究表明，BMP?7除了诱导成骨外，还具有广泛的生物学活性3 6。由于 hBMP?7S 神经系统 及造血组织中的特殊作用，故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我 们采用自行设计合成的一对特异性引物，以骨肉瘤的入 gt11 噬菌体表达文库为模板，通过 PCR 扩增到 hB

2、MP?7 成熟肽的 cDNA 将其克隆入载体 pGEM?3zf，所获序列与已发表的序列完全一致，为进一步对其表达和功能研究创造了条 件。1PCF 产物的琼脂糖凝胶电泳分析1:PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377 和 237bp); 2： PCR产物2 重组质粒 pGEB7 的酶切鉴定1：PCRmarker 从上至下为： 1543， 994, 697， 515， 377 和 237bp); 2:重 组质粒 pGEB7 的 EcoRI+Hindill 双酶切.1 材料和方法1.1 材料大肠杆菌 DH5x 及质粒 pGEM?3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞 U

3、2-OS 的入 gt11 噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内切酶、连接酶和 Taq 酶均为 Gibco 公司的产品。AdvantagePCR-purekit 为 Clontech 公司产品。 常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCFT增引物自行设计，由上海生物工程 中心合成。引物的序列如下：P1：5TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3P2: 5 GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG31.2 方法1.2.1hBMP?7 成熟肽基因的扩增 PCF 反应体系：P1 和 P2 引物(20mmol/L)各 1 卩 L,dNTP(10mmol/L)1 卩 L,模板 入 gt11

4、 噬菌体 3 卩 L, 10XPCRbuffer5 卩 L 和 Taq 酶 1U,加水至总体积 50 卩 L。PCR 反应条件：94C30s, 50C30s, 72C30s 反应 5 个循环。然后，于 94E30s, 55E30s, 72C30s,反应 30 个循环。PCR 产物用 15g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.2 重组质粒的构建用 Hinell 酶切载体 pGEM?3zf(-)并回收，同时回收 PCR 产物，用 T4 连接酶连接，转化感受态细胞 DH5x，筛选阳性克隆。1.2.3 序列测定利用 PE 公司 ABI310 型全自动核酸测序仪进行。2 结果2.1hBMP-7 成熟肽基因

5、的扩增以 入 gt11 噬菌体表达文库为模板，利用自行 设计的一对引物，进行 PCF 扩增 hBMP-7 成熟肽基因。经两段反应共 35 个循环 后，用 15g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约440bp 的特异条带，与预期的大小 相一致(1)。2.2 重组质粒的构建回收 440bp 片段，在 T4 连接酶作用下，与用 Hindi 酶切的质粒 pGEM?3zf(-)于 16E连接过夜。以连接产物转化感受态细胞 DH5x，加入 IPTG 和 X-gal 进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆， 提取质粒， 用 限制性内切酶 EeoRI 和 HindIII 双酶切。 经 15g/L 琼脂糖凝胶鉴定表明， 切

6、出 440bp片段者为阳性克隆，将此重组质粒命名为 pGEB72.3 序列测定利用 PE 公司 ABI310 型全自动核酸测序仪测定 hBMP?成熟肽 基因的序列，所得结果与已发表的序列完全一致 (3) 。TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCCCTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAGCACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(1GGCTACGCCGCCTAC

7、TACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(2GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACTTCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(3AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(36TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(42 3BMP?7 成熟肽编码基因的部分核苷酸序列3 讨论hBMP-7 具有广泛的生物学活性：胚胎发育中所产生的BMP-7 和 BMP

8、-4 是诱导交感神经元分化的信号分子。能抑制胚胎癌性细胞 (ECC)的增殖，诱导其 分化，可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。对牙齿的修复、形成有重要作 用。对鼠胚胎菱脑的发育和形成有一定影响，为哺乳动物眼部发育所必需5。剔除(knock?out)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良，提示其可 能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关，从而使其在基础研究和临 床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7 较少，限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达 BMP-7 只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究7，并获得活性产物。以往认为，BMP 原核表达后，难以获 得高活性的产物

9、，且表达产物往往处于非溶解状态，可溶性产物的量极少。近 来本室在原核表达的 BMP-2 的复性方面获得了突破8，可得到大量可溶性重组 BMF 产品，为其体外活性测定方法的建立及功能研究提供了极大的便利。为进 一步阐明 BMP?7 吉构与功能的关系，研究其在肾脏、神经系统发育及造血系统 中的作用，克隆BMP-7 成熟肽基因很有必要。我们以骨肉瘤细胞 U2-0S 的入 gt11 噬菌体表达文库为模板，利用自行设计 的一对引物，仅一轮扩增即得到单 1 条带。测序吉果表明，设计的引物特异性 强，扩增得到的基因正确。将扩增产物以平端克隆入载体pGEM?3zf（-），可避免由于酶切处理过程的损失，无论是正

10、向或反向克隆入载体都不影响测序，而 且不会破坏引物中所含的酶切位点和起始密码子。hBMP-7 成熟肽基因克隆的成功，为其原核表达以及功能研究和应用奠定了基础。 作者简介： 王琦，男， 24 岁，助教现工作单位：兰州市段家滩 171 号，解放军 兰州医高专生化教研室， Tel.(0931)8972157 ? 2000 by J Cell MolImmunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. ISSN 1007? 8738 细 胞 与分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3)王琦（第四军医大学生物化学与分子

11、生物学教研室，陕西西安 710032） 柴玉波（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 李毅（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 陈南春（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 薄勤（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032） 陈苏民（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032）参考文献： 1 Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identification of transforming growth factor fa

12、milymembers present in bone inductive protein purified form bovine boneJ. Proc Natl Acad Sci USA,1990;87:9843 9847.2 0zkaynak E, Rueger DC, Drier EA, et al. 0P? 1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF?Bfamily J. EMBO J, 1990; 9: 2085 2093.3 Reissmann E, Ernsberger U, Francis? West PH, et al.

13、 Involvement of BMP4 and BMP7 indifferentiation of the adrenergic phenotype in developing sympathetic neuronsJ. Development, 1996;122(7):2079 2088.4 Giannobile WV, Ryan S, Shih MS, et al. Recombinant human osteogenic protein? 1 (OP? 1)stimulates periodontal wound healing in class III furcation defec

14、tsJ . J Periodontol,1998; 69(2):129137.5 Arkell R, Beddington RS. BMP? 7 influences pattern and growth of the developing hind? brain ofmouse embryosJ . Development,1997; 124:1 12. 6 Luo G, Hofmann C, Bronckers AL, et al. BMP? 7 is an inducer of nephrogenesis, and is alsorequired for eye development and skeletal patterni