几种瓜类作物枯萎病病原菌的分子鉴定及其ITS序列差异性分析

1、几种瓜类作物枯萎病病原菌的分子鉴定及其its序列差异性分析郑雪芳蓝江林曹宜 肖荣风车建美刘波*(福建省农业科学院生物技术研究所福州350003)摘 要:比较和分析了福建省儿种重耍瓜类作物枯萎病病原菌的its区序列，结果农明，供试的26个菌株属丁两种不同 类型的镰刀菌：尖他镰刀菌和串珠镰刀菌，其中尖他镰刀菌所占比例较大(54%),为优势种。另外，对尖他镰刀菌 和串珠镰刀菌的its区序列进行比对分析，结果显示，这两种类型菌株的差界主要表现在1ts2区间，差界达20.4%,而 its1区间的序列完全相同或只冇1个碱基的差异。对26株供试菌进行亲缘关系分析表明，在同源系数为92%的条件下， 26株镰刀

2、菌被划分为2个类群：第1类为尖泡镰刀菌，第2类为串珠镰刀菌。其中，第2类群中的串珠镰刀菌在同源系数 为99%的条件下乂被细分为2个类群。关键词：镰刀菌；分类；鉴定；its序列分析identification and classification of fusarium wilt from cucumber, melon,watermelon and bottle gourd in fujianzheng xue-fang liu bo lan jiang-lin cao yi xiao rong-fcng che jian-mci(biotechnology institute, fujian

3、 academy of agricultural sciences, fuzhou 350003, china)abstract:an experiment was conduced to compare and analyze sequece of its-rdna lied in fusarium wilt from some important cucumis species in fujiang result showed that 26 teste strains were belong to two different types: fusarium oxysporum and f

4、usarium tnonilifonne.the percent of fusarium oxysporum, which was dominant species, was 54% in the total tested stniins.its sequence blast analysis was applied in fusarium oxysporum and fusarium moniliforme, result showed that main differece of two type fusarium strains lied in its2, the differenc o

5、f them was significant at 20.4% level, however, its1 sequences of them were absolutely identical or one base differece.the phylogenetic tree of 26 tested strains indicated that 26 tested strains was divided into two major groups while the homology confficient was 92%.the first group was fusarium oxy

6、sporum and the second group was fusarium moniliforme, which was subdivided into two groups while the homology confficient was 99%key word:fusarium; classification; identification; iis sequence analysis瓜类作物枯萎病是由致病性镰刀菌引起的，是瓜类作物生产中重大病害z-o传统对病原真菌的 分类、鉴定主要基于形态特征、生理生化指标、致病性测定等，但大部份真菌种类多、分布广、形态 特征复杂，不能对未知菌

7、株进行准确鉴定，而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳 定()。因此,传统的菌株分类鉴定方法引起分类系统的不稳定或意见分歧。随着分子生物技术的发展， rapd、ssr、aflp、its等分子标记技术被广泛应用于病原真菌的的鉴定(nicholson et al. , 1993), 分类(alalounakis, 1999 ； crowhurstrn et al, 1995)、分化(crowhust et a 1., 1991)及群体遗传多样性 (paul etal., 2000； vainioetal., 1998)研究屮。其中克隆和测序真菌核糖体基因，根据其特点进行真 菌分类、鉴定

8、和系统发育的研究成为病理学研究新热点(lee s, 1992； cooke d e l, 1999： skouhoe, 1999) o棊金项h：国家“八六三”计划项h(2002aa244031-2)；福建省自然基金(2006j0068)"通讯作者：刘波，博士，研究员,主要从事生物技术和生物农药研究;e-mail： fzliubo第一作者:郑雪芳(1977-),女，硕士,主要从事植物病理学及生物防治研究;e-mail: zhengxuefang2003。本研究在前期传统的形态鉴定基础上，利用核糖体dna-its区序列来辅助鉴定不同瓜类寄主作物 上分离的枯萎病病原菌类型及种群划分。1供试

9、菌株1.1供试菌株26株分离口不同瓜类寄主作物（黄瓜、甜瓜、西瓜和瓠瓜）的镰刀菌单沦株，经菌株的 菌落、分主抱子、分牛砲子梗、厚垣殖子等的形态特征观察，初步鉴定为镰刀菌。其屮部份菌株为前 期试验中已经专化型鉴定的菌株（具体见表1）table 1 test strains of fusariumnohoststrainlocationspecialized formpathogenicity1f-h.6.5-030318-02 (119)zhangzhou zhaoaneoxysporum .cucumerimipathogenic2fm-h.6.5-030318-()4 (120)zhangz

10、hou zhaoanhluncheckedpathogenic3cucumberf-h.6.5-030318-01 (121)zhangzhou zhaoaneoxysporum .cucumerinunonpathogenic4fm-h.6.5-030318-12 (122)zhangzhou zhaoanartuncheckedpathogenic5fm-h.6.5-030318-13(123)zhangzhou zhaoanuncheckedpathogenic6fm-h.6.5-030318-11 (124)zhangzhou zhaoanuncheckedpathogenic7f-t

11、.l.7-030514-12 (129)fuzhou yongtaieoxysporum .melonispathogenic8f-t. 1.7-030514-21 (130)fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic9f-t.l.7-030514-31 (131)fuzhou yongtaieoxysporum .melonispathogenic104plnnfm-t. 1.7-030520 (132)fuzhou yongtaiuncheckednonpathogenic11iv1 vlwllf-t, .1-030616-01(144)fuzhou yongtai

12、uncheckedpathogenic12f-t2.1-030616j5 (145)fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic13f-t. 1.7-040427-1 (219)fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic14fm-t. 1.7-040427-3 (221)fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic15fm-x. 1.7-030520-02 (133)fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic16fx.7-030520-03(134)fuzhou yongtaif.oxysporum .

13、niveumpathogenic17fm-x. 1.7-030520-11 (135)fuzhou yongtaiuncheckednonpathogenic18f-x. 1.7-030520-12 (136)fuzhou yongtaieoxysporum .niveumpathogenic19wilt arm a innf-x.l.7-030520-13 (137)fuzhou yongtaif.oxysporum .niveumpathogenic20w <11vi 111vimilfm-x. 1.7-030527-02 (139)fuzhou yongtaiuncheckedpa

14、thogenic21f-x. 1.7-030527-11 (140)fuzhou yongtaif.oxysporum .niveumpathogenic22f-x.1.7-030527-12(141)fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic23fm-x. 1.7-030527-31fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic24fm-x. 1.7-030527-08fuzhou yongtaiuncheckedpathogenic25bottlef-g 1.5-031017-01(173)fuqinguncheckedpathogenic26g

15、ourdfm-g 1.5-031017-05( 174)fuqinguncheckedpathogenic1.2生化试剂dna纯化回收试剂盒、高保真tapplus i dna聚合酶购白杭州烛h科技有限公司，具它牛化试剂 购白上海生工生物工程有限公司或为国产分析纯试剂。1.3 its区扩增ctab法提取菌株dna ,引物根据文献（杨红，2002）设计合成，序列：primer 1 5,cttgcgttgattacgtccc 3，, its4 5,tcctccgcttattgatatgc 3：引物设计见图 1 pcr反应 的总体积为25 ul,含有 1 个单位的taq酶，10 x buffer 2.

16、5 口 l, dntp 0.2ul, 10um/l的primer 1 和its4 各1ul, dna模板25ngo pcr扩增程序：94°c预变性lomin, 94°c变性lmin, 55°c退火lmin, 72°c延 伸2min,共25个循环，最后72°c延伸lomin。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，切出目的片段，经纯化后 送往上海生工生物工程冇限公司进行pcr产物双向直接测序。primer 118s rdianudeartage qna '28s rdva图:its |x pcr扩增引物设计示意图fig 1 sketch of sho

17、wing the positions of pcr amplification primers of its region1.4 its区序列分析测序结果中每个样品的双向序列用dnastar软件中seqman进行拼接并输出全序列，将获得的序 列与genbank核酸序列数据库进行同源序列比对分析，用dnaman version 5.2.2.0软件对26个菌株 的序列进行聚类分析。2结果分析2.1 its区扩增结果供试26株镰刀菌菌株的核糖体its区扩增结果如图2所示，26株不同寄主、不同专化型及不同 致病力的镰刀菌菌株扩增带型一致，都扩增出单一条带，大小为700-8000bp z间。m 1 23

18、 15678 910 11121311151617181920212223242526 27ck出）0叶_二700bp-> ;图2：供试菌株的its-pcr扩增图谱m： 5000bp dna ladder；泳道编号126为表1中所列菌株;ck：清水空白对照fig2： its-pcr patterns of test strainsm： 5()0()bp dna ladder； 1 26： isolates listed in table 1 ； ck： negative control2.2 its区序列测定结果序列测定结果显示，序列长度为676bp691bp不等，序列中包含部份18s

19、1rnajtsh5.8s rrna、 its2及部份28 s rrna,部份菌株碱棊编码序列如图3所示。菌株 f-h.6.5-030318-j1 的序列1ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac faccga1tga aiggcrcagt gaggcgtccg gacfggccca71gagaggtggg caactaccac tcagggccgg aaagctctcc aaactcggtc atttagagga agtaaaagtc141gtaacaaggt ctccgttggt ga acc a gcgg a gggatcatt accg/gttta c a a c

20、tccc a a a cccctgtg 八211acataccact tgttgcctcg gcggatcagc ccgctcccgg taaaacggga cggcccgcca gaggacccct281aaactctgtt tctatatgta acttctgagt aaaaccataa ataaatcaaa actttcaaca acggatctct351tggttctggc atcgatgaag aacgcagcaa aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca421tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc agtatt

21、ctgg cgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac491cctcaagcac agcttggtgt tgggactcgc gttaattcgc gttccccaaa ttgattggcg gtcacgtcga561gcttccatag cgtagtagta aaaccctcgt tactggtaat cgtcgcggcc acgccgttaa accccaac7tt631ctgaatgttg a cctcggatc a ggtagg a at acccgctgaa ctta ag菌株f-t. 1.7-030520的序列icrgcccritg tacacacccg ccc

22、gtcgcfa ctaccgaitg aaeggctcag tgaggcgtcc ggactggccc71agagaggtgg gcaactacca ctcagggccg gaaagctctc caaactcggt catttagagg aagtaaaagt141cgtaacaagg tctccgttgg tgaaccagcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aacccctgtg211 aacataccac ttgttgcctc ggcggatcag cccgctcccg g1aaaacggg acggcccgcc agaggacccc281taaactctg

23、t ttctatatgt aacttctgag taaaacctyta am'aaatcaa aactttcaac aacggatctc351 ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagca aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc421atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagtattctg gcgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa491ccctc a a gcc ctcgggtttg gtgttgggga tcggcg agcc cttgcggca a gccggc

24、cccg a a 八tctagtg561 gcggtctcgc tgcagcctcc attgcgtagt agtaaaaccc tcgcaactgg aacgcggcgc ggccaagccg631ttaaaccccc aacttctgaa tgttgacctc ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa g由于its1和its2这两个区间进化较快，含信息量丰富，故挑取这两个区间來做分析，具体见表2。 从表中可以看出26个菌株的its2区序列长度均长于its1,不同菌株its1区序列长度变异较小，从 147bp148bp,而its2区序列长度变异较大,从151bp165

25、bp。its1区间gc含量在49.0%49.7% zi'可变化，its2区间gc含量在51.7%61.3%之间变化，its2区问的gc含量髙于its1,且变化辐 度也大于 its1 ,部份菌株(fm-h.6.5-030318-04 > fm-h.6.5-030318-12 > fm-h.6.5-030318-13 > fm-t. 1.7-030520 fm-x. 1.7-030520-02 fm-x.7-030520-11、fm-x. 1.7-030527-02 > fm-x. 1.7-030527-31、 fm-x.l.7-030527-08> fm-t

26、j.7-040427-3> fm-gl5-031017-05)的 its2 区间的 gc 含量高达 60%以fig2 analysis of its 1 and its2 regions of 26 strainsnostrainits1its2length (bp)gc pcrccnt(%)length o(bp)gc pcrccnt(%)1f-h.6.5-030318-0214749.715151.72fm-h.6.5-030318-0414749.016560.63f-h.6.5-030318-0114749.715152.34fm-h.6.5-030318-1214749.016

27、560.65fm-h.6.5-030318-1314749.016560.66fm-h.6.5-030318-1114749.716561.27f-t. 1.7-030514-1214849.315151.78f-t. 1.7-030514-2114849.315151.79f-t. 1.7-030514-3114749.715151.710fm-t. 1.7-03052014749.716561.211f-t2.1.1-030616-0114749.715152.312f-t2.l.l-030616-1514749.715152.313f-t. 1.7-040427-114749.71515

28、1.714fm-t. 1.7-040427-314749.716561.315fm-x. 1.7-030520-0214749.016560.616f-x.l .7-030520-0314849.315151.717fm-x. 1.7-030520-1114749.716561.218f-x.l.7-030520-1214849.315151.719f-x.l.7-030520-1314849.315151.720fm-x. 1.7-030527-0214749.716561.221f-x.l.7-030527-1114849.315151.722f-x.l.7-030527-1214849.

29、315151.723fm-x. 1.7-030527-3114749.016561.224fm-x .1.7-030527-0814749.716561.225f-g. 1.5-031017-0114749.715152.326fm-g. 1.5-031017-0514749.716561.22.3测序结果与genbank核酸序列数据库进行同源性比较将所得序列在genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索。根据renske landeweert等()对 真菌的分了分类原则：即认为通过its区域比对，序列相似性399%，鉴别为相同种；序列相似性 大于95%且小于99%，鉴别为相同属；序列相似性

30、w95% ,鉴别为相同科。菌株f-h.6.5-030318-02.f-h.6.5-030318-0k f-t. 1.7-030514-12 f-t. 1.7-030514-21 > f-t. 1.7-030514-31 > f-t2.1.1-030616-01 > f-t2.l()3()61615、f-x. 1.7-030520-03、f-x.l.7-030520-12> f-x.l.7-030520-13> fx.7-030527-11, f-x. 1.7-030527-12、f-t. 1.7-040427-1 > f-g. 1.5-031017-01 与

31、尖抱镰刀菌(.f.oxysporum)的同源性最 高,达99%以上，推定这些菌株为尖泡镰刀菌;菌株fm-h.6.5-030318-04 fm-h.6.5-030318-12> fm-h.6.5-030318-13 > fm-h.6.5-030318-11> fm-t. 1.7-030520. fm-x. 1.7-030520-02 > fm-x .1.7-030520-11、 fm-x. 1.7-030527-02、fmx.7030527-31 、 fm-x. 1.7-030527-08、 fm-t. 1.7-040427-3、fm-g. 1.5-031017-05与串

32、珠镰刀菌(f.numill伽me)的同源性最髙，达99%以上,推定这些菌株为串珠 镰刀菌。2.4基于its区间序列的聚类分析用dnaman version 5.2.2.0软件对这27株镰刀菌的its区序列(包括its1、5.8s、its2)进行 多重同源性比较，构建分了系统树(图3)。在同源系数为92%的条件下,供试的27株菌被划分为2个类 群：第1类为尖抱镰刀菌,共有14株,占54%,代表菌株f-h.6.5-030318-02；第2类为串珠镰刀菌, 共有 12 株，占 46%,代表菌株 f-h.6.5-030318-04o100%9s%90%f-h.6.5-030318-01f-t2.1.1

33、-030616-01f-t2.1.1-030616-15f-o.1.5-031017-01f-t.1.7.o3o3m-i2f-t. 1.7-030514-21100%f-t. 1.7-030514-31f-x. 1.7-0305 20-03f-x.1.7-o3o52o-12f-x. 1.7-0305 20-13f-x.l.7-030527.11f-x.l.7-030527-12f-t.l.7-040427-1f-h.6.5-030318-02fm-h.6.5-030318-04fm-h.6.5-030318-12fm-il6.5-030318-13fm-x. 1.7x)30520-02fm-x

34、. 1.7)30527.31fm-h.6.5-03031811fm-t.1.7-030520fm-x. 1.74)30520-11fm x17«030s2702fm-x. 1.7)3052708em-0.1.s-03101703100%100%99%fm-t.l.7-040427-3fig 3 polygenetic tree based on its另外，笫1类群中的尖他镰刀菌各菌株its区间的同源性达100%,而笫2类群的串珠镰刀菌,在同源系数为99%的条件下，又被细分为2个类群，菌株fm-h.6.5-030318-04 fm-h.6.5-030318-12 fmh.6.5030

35、31813、fm-x. 1.7-030520-02 和 fm-x.l.7-030527-31 的同源性为 100%聚为一类,菌株 fm-h.6.5-030318-11、fm-t. 1.7-030520、fm-x.l .7-030520-11、fm-x. 1.7-030527-02、fm-x.l .7-030527-08、 fm-t. 1.7-040427-3 和 fm-g. 1.5-031017-05 的同源性为 100%聚为一类。2.5尖抱镰刀菌和串珠镰刀菌its序列的差异性分析应用dnaman version 5.2.2.0软件对木研究屮分离的两种类型菌株(尖抱镰刀菌和串珠镰刀菌) 的it

36、s1和its2分别进行比对分析，结果表明，两种类型菌株的its区序列差界主要在于its2区间 的差异，如图4所示(图中阴影部份表示两类菌株在该位点的差异碱基)，两类型菌株在its2区的序 列差异达20.4%,而它们的its1区间的序列完全相同或有1个碱基的差异(图5), its2区的序列差异 类型为碱基的置换(其中转换：颠换=9 : 25)和碱基的缺失。6048120107monil iforme caaccctcaagccctcgggtttggtgttggggatcggcgagcccttgcggcaagccx3gccoxysporum caaccctcaagcacagc ttggtgttgg

37、gactcgcgttaattcgcgttcmoniliforme ccgaaatctagtggcggtctcgctgcagcctccattgcgtagtagtaaaaccctcgcaac oxysporum cccaaattgattggcggtcacgtcg agcttccatagcgtagtagtaaaaccctcgttacmoniliformetggaacgcggcgcggccaagccgttaaacccccaacttctgaat164oxysporumtggtaatcgtcgcggccacgccgttaaa ccccaacttctgaat150图4尖砲镰刀菌和串珠镰刀菌的its2区序列比

38、对分析结果moniliforme oxysporumfig 4 sequence alignment of the its2 of f.oxysporum and f.moniliformeccgagtttacaactcccaaacccctgtgaacataccaattgttgcctcggcggatcagccccgagtttacaactcccaaacccctgtgaacataccacttgttgcctcggcggatcagcc6060monilifomeoxysporumcgctcccggtaaaacgggacggcccgccagaggacccctaaactctgtttctatatgtaacg

39、ctcccggtaaaacgggacggcccgccagaggacccctaaactctgtttctatatgtaa120120moniliforme cttctgagtaaaaccataaataaatc oxysporum cttctgagtaaaaccataaataaatc146146图5为尖他镰刀菌和串珠镰刀菌的its1区序列比对分析结果fig 5 sequence alignment of the its 1 of f.oxysporum and f.moniliforme2.6尖孑包镰刀菌菌株间its序列的怎界性分析2.7串珠镰刀菌菌株间its序列的并异性分析3讨论依据形态特征和生理

40、生化指标是植物病原真菌的的传统分类鉴定方法，也是其分类鉴定的基础, 但此方法比较费时，常常需要2-3周才能获得结呆，有吋培养物不典型或不产孑包，使得鉴定困难，甚至难 以鉴定。因此，片前根据dna水平的差界进行真菌的分类鉴定、系统发育研究越来越得到重视。由 于its区在绝人多数真核生物屮表现出极为广泛的序列多态性，同时its区序列长度适中，从3()()bp - looobp不等，可以从不太长的序列中获得足够的信息，因此，人们常常将这一可变区作为真菌菌种和 分离物鉴定的可靠依据之一(schmidt&morcth, 2002),如 lee and taylor( 1992)对-疫霉属(phy

41、tophlhora) 种间关系的研究,yao ct al (1999).对干酪菌(tyromyces s.l.)系统学的研究,skouboc ct al (1999) 对青霉属(peniciilium)的研究，cooke et al. ( 1999)对栋疫霉(phytophthoraquercina)种的鉴泄等等。本研究对26株分离口不同瓜类作物的镰刀菌进行初步的形态鉴定为镰刀菌，经its区序列同源性搜 索发现它们属于镰刀菌属的2个不同种:尖抱镰刀菌和串珠镰刀菌，其屮部份菌株经形态鉴定初步认为 是尖抱镰刀菌，但经过its区序列的同源性比对发现它们属于串珠镰刀菌，说明形态鉴定有它的局限 性，对耒

42、知菌株的鉴定应该结合分子生物学手段辅助鉴定以达到更加精确结果。由于尖施镰刀菌和串 珠镰刀菌的菌落及镜下形态类似，若不是经验性强的专家，很难将它们准确区分，而genbank核酸序 列数据库屮有关镰刀菌属许多种的its序列，所以可以通过测定镰刀菌rdna基因its序列来辅助鉴 定镰刀菌，这必将使得病原真菌的鉴定趋于完善。(拿尖泡镰刀菌和串珠镰刀菌泡子图进行比较说明)木研究首次通过its区序列对瓜类作物枯萎病病原菌进行分类分析，研究表明，供试的26株福建 省儿种不同瓜类寄主作物的枯萎病病原菌被划分为2大类样，第一类群为尖沦镰刀菌，共有14株，占 总菌株54%,说明尖砲镰刀菌是瓜类作物发牛:枯萎病菌的

43、优势菌，是瓜类作物枯菱病的主要致病菌， 这一结果与刘志恒等(2002)认为尖砲镰刀菌是引起瓜类作物枯萎病成灾的主要病原菌的结论是一致 的；第二类群为串珠镰刀菌，共有12株，占总菌株46%,其屮包括1株甜瓜上的非致病菌株和1株酋瓜 上的非致病菌株。另外，从菌株的聚类分析图可以看出，来口不同专化型的菌株its区序列可以完全 相同(如甜瓜专化型菌株f-h.6.5-030318-j1和西瓜专化型菌株f-x. 1.7-030520-03),而同一专化型的 菌株its区序列也有可能存在一定的差开(如甜瓜专化型的两个菌株f-t. 1.7-030514-12和ft.1.7 030514-31的its区序列存在

44、1个碱基的差界)，说明its区序列无法用于区分菌株的专化型。这一结论 与余仲东等(2006)认为its区序列在属内种间羌异鉴别具有一定的参考价值，但不适合种内或种下 阶元的鉴定和分类的观点相吻合。本研究对26株分离自不同瓜类作物的枯萎病病原菌的1ts1和its2区间序列进行比较，发现供试菌 株its2区序列的长度和gc含量它们的变化辐度都大于1ts1区序列，说明its1比its2保守，its2具冇 更强的多态性。另外，通过对本试验屮分离的两种类型菌株：即串珠镰刀菌和尖也镰刀菌的its区序 列进行比对分析，结果表明串珠镰刀菌和尖他镰刀菌的its区序列差异主耍在于its2区间，该区间的 序列差异主

45、要表现在碱基的置换和碱基的缺失，主要是发生碱基的颠换(转换：颠换=9 : 25),而its1 区间序列完全相同或有1个碱基的差界，因此，可以利用菌株的its2区间的序列做为进一步研究镰丿j 菌种内的进化的一个判别指标。referencesschmidt o, moreth u, 2002. data band of rdna-its sequences from building-rot fungi for theiridentificationjj. wood science and technology, 36:429-433lee s, taylor j. phylogeny of fi

46、ve fungus-like protoctistan phytophchora species, inferred from the internal transcribed spacer sequence ribosomal dnaj. mol biol evol, 1992, 9:636-653cooke del. molecular evidence supports phytophthora quercina as a disti net speciesj. mycol res, 1999, 103(7):799-804skouboe p, 1999. phylogenetic an

47、alysis of nucleotide sequences from the its region of terverticillatepenicillium speciesjj. mycol res, 103(7):873-881renske l, paula l, thomw k, 2003. molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizonsfj. applied and environmental microbiology, 69(1):327-333gardes m, bruns t d, 1996. its-rflp matching for identification of fungia. in: clapp j p, ed. species diagnostics protocolsc