(完整版)5.2多聚酶链式反应扩增DNA

1、dnadna多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增dnadna片断片断课题21 1、多聚酶链式反应的概念、多聚酶链式反应的概念一一 、课题背景、课题背景2 2、多聚酶链式反应的应用：、多聚酶链式反应的应用： 的诊的诊断、断、 、 、 和和dnadna 等各方面。等各方面。遗传疾病遗传疾病刑侦破案刑侦破案 古生物学古生物学基因克隆基因克隆序列测定序列测定1 1、dnadna分子的组成成分和结构分子的组成成分和结构dna dna 分子的基本组成单位是分子的基本组成单位是 . .共有共有 种种, ,每个基本单位是由一分子每个基本单位是由一分子的的 、一分子的、一分子的 、和一分子的和一分子的 构成。构

2、成。脱氧核甘酸脱氧核甘酸4 4磷酸磷酸碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖二二 、基础知识、基础知识模板：模板：dnadna的两条链的两条链：2 2、dnadna分子复制的过程分子复制的过程参与的组分参与的组分在在dnadna复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶打开打开dnadna双链双链dnadna母链母链提供提供dnadna复制的模板复制的模板4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸合成子链的原料合成子链的原料dnadna聚合酶聚合酶催化合成催化合成dnadna子链子链引物引物使使dnadna聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3 端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸dnadna双链反向平行双链反向平行

3、35531 1、dnadna分子的分子的3 3 端与端与5 5 端端-oh-oh端为端为3 3 ; ; 磷酸基团的末端为磷酸基团的末端为5 5。2 2、dnadna分子由两条分子由两条反向平行反向平行的脱氧核苷酸的脱氧核苷酸链根据链根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则形成形成氢键氢键连接而连接而成。成。基本单位基本单位atgcatgc3355解旋酶解旋酶dnadna母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸dnadna聚合酶聚合酶引物引物（ rna）打开打开dnadna双链双链模板模板合成子链原料合成子链原料催化子链合成催化子链合成使使dnadna聚合酶能从引聚合酶能从引物物3 3端开始连接脱端开

4、始连接脱氧核苷酸氧核苷酸 思考：思考：3 3、是什么？是什么？ 体外扩增体外扩增dna dna 如何提供相似环境？如何提供相似环境？ 变性变性（ 80-100 ）taqtaq聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）20203030个核苷酸构个核苷酸构成成dnadna或或rnarnadna双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100 ）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）4 4、dna dna 分子的热变性原理：分子的热变性原理：变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合（一）（一） 、pcrpcr技术的原理技术的原理

5、 利用利用dnadna分子的分子的热变性热变性原理，通过控制原理，通过控制温度温度来控制双链的来控制双链的解聚解聚与与结合，结合，从而完成从而完成体外体外dandan分子的扩增分子的扩增。 体外体外dnadna复制的条件：复制的条件： 四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。和严格控制温度的温控设备。 复制的方向：复制的方向：子链的子链的5 5端向端向 3 3端延伸。端延伸。（一）、（一）、pcrpcr技术原理技术原理pcrpcr参与的组分参与的组分在在dnadna复制中的作用复制中的作用高温变性高温变

6、性解旋酶解旋酶打开打开dnadna双链双链dnadna母链母链提供提供dnadna复制的模板复制的模板4 4种脱氧核种脱氧核苷酸苷酸合成子链的原料合成子链的原料taqtaq酶（耐高温）酶（耐高温）dnadna聚合酶聚合酶催化合成催化合成dnadna子链子链20-3020-30个核苷酸构个核苷酸构成成dnadna或或rnarna单链单链引物引物使使dnadna聚合酶能够从聚合酶能够从引物的引物的3 3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸（二）、（二）、pcrpcr的反应过程的反应过程每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的从第二轮循环开始，上一次

7、循环的产物也可以作为模板参与反应，并且产物也可以作为模板参与反应，并且由由引物引物延伸而成的延伸而成的dnadna单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行dnadna的延伸，的延伸，这样，这样，dnadna聚合聚合酶只能特异性地复制酶只能特异性地复制处于两个引物之间处于两个引物之间的的dnadna序列序列，使这段固定长度的序列，使这段固定长度的序列呈呈指数扩增指数扩增。反应周期高温变性高温变性低温复性低温复性(退火退火)适温延伸适温延伸反应循环数：扩增倍数：109以上以上30多次多次 以便增加大分子模板以便增加大分子模板dnadna彻底变性彻底变性的概率的概率（二）、（二）、pcrpcr的

8、反应过程的反应过程1 1、循环之前的一次预变性、循环之前的一次预变性2 2、pcr pcr 一般要经历一般要经历三十多三十多次循环次循环5/3/ggtc3/5/gacc5/3/ag引物引物5/3/gg引物引物变性变性复性复性延伸延伸复制过程复制过程5/3/ggtc5/3/ggtc5/3/ga引物引物5/3/ga引物引物5/3/gg引物引物5/3/ga引物引物3/ 3/5/gacc3/5/gacc5/3/gg引物引物5/3/gg引物引物5/3/gg引物引物3/5/3/ga引物引物 （1 1）变性：当温度上升到变性：当温度上升到90 90 以上时，以上时，双链双链dnadna解聚为单链。解聚为单链

9、。 （2 2）复性：温度下降到）复性：温度下降到50 50 左右，两种左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链引物通过碱基互补配对与两条单链dnadna结合。结合。 （3 3）延伸：温度上升到）延伸：温度上升到7272左右，溶液中左右，溶液中的的四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(a(a，t t，c c，g)g)在在dnadna聚合聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的新的dnadna链。链。（二）、（二）、pcrpcr的反应过程的反应过程3 3、每个循环包括、每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸（1 1）pcrpcr循环循环- -变性变性9595变性变

10、性（1 1）pcrpcr循环循环- -变性变性9595变性变性（1 1）pcrpcr循环循环- -变性变性9595变性变性（2 2）pcrpcr循环循环复性复性5555复性复性（3 3）pcrpcr循环循环延伸延伸（3 3）pcrpcr循环循环延伸延伸（3 3）pcrpcr循环循环延伸延伸（3 3）pcrpcr循环循环延伸延伸4 4、循环特点：、循环特点：上一次循环的产物为下一循环的模板上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条（无引物结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代存在于两个子代dnadna分子中分子中 其它子代其它子代dnadna分子都为双引物分子式分

11、子都为双引物分子式 处于两引物之间的处于两引物之间的dnadna序列呈指数增长序列呈指数增长1 12 2n n实验操作步骤：实验操作步骤：（准备）（准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上按配方将所需试剂摆放在实验桌上（移液）（移液）用用微量移液器微量移液器按配方在微量离心管按配方在微量离心管中依次加入各组分中依次加入各组分（混合）（混合）盖严盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻口的盖子，用手指轻轻弹击管壁弹击管壁（离心）（离心）将微量离心管放在将微量离心管放在离心机离心机上上（反应）（反应）将离心管放入将离心管放入pcrpcr仪仪上，设置好上，设置好pcrpcr仪的循环程序仪的循环程序 三、实验

12、步骤：三、实验步骤：准备准备好好pcrpcr反应体系的配方反应体系的配方用微量用微量移液器移液器按配方在往微量按配方在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁管壁混合混合反应液反应液离心离心10s10s将离心管放入将离心管放入pcrpcr仪上，设置好仪上，设置好循环程序进行循环程序进行反应反应四、操作提示：四、操作提示： 操作提示操作提示 1 1为避免外源为避免外源dnadna等因素的污染，等因素的污染，pcrpcr实验中实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行在使用前必须进

13、行高压灭菌高压灭菌。 2 2pcrpcr所用的缓冲液和酶应所用的缓冲液和酶应分装成小份分装成小份，并，并在在-20-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在放在冰块上缓慢融化冰块上缓慢融化。 3 3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换枪头都必须更换。所有。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微，再将微量离心管放在离心机上，离心约量离心管放

14、在离心机上，离心约10s10s，使反应液，使反应液集中在离心管底部，再放入集中在离心管底部，再放入pcrpcr仪中进行反应。仪中进行反应。目的：目的：避免外源性避免外源性dna大量扩增造成假阳性反应。大量扩增造成假阳性反应。五、结果分析与评价五、结果分析与评价 1 1、原理：、原理：dnadna在在260nm260nm的紫外线波段有的紫外线波段有一强烈的吸收峰一强烈的吸收峰( (图图5-11)5-11)。可以利用。可以利用dnadna的这一特点进行的这一特点进行dnadna含量的测定。含量的测定。注意事项：详见操作提示注意事项：详见操作提示 五、结果分析与评价五、结果分析与评价dna 含量的测

15、定：稀释含量的测定：稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见p63）波长波长260nm260nm处处读数读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照5050倍倍实验结果与分析实验结果与分析dnadna含量含量(ug/mi)=50 (ug/mi)=50 （260nm260nm的读数）的读数） 稀释倍数稀释倍数六、课题延伸六、课题延伸 1 1、pcrpcr优点：优点： 2 2、pcrpcr技术的应用技术的应用p58p58原理虽然复杂，但操作却十分简单。快原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作速、高效、灵活和易于操作 pcrpcr技术与体内技术与体内dnadna复制的区别：复制的区别

16、： 1. pcr 1. pcr不需要解旋酶；体内不需要解旋酶；体内dnadna复制复制需要；需要； 2. pcr 2. pcr需要耐热的需要耐热的dnadna聚合酶（常用聚合酶（常用taqdnataqdna聚合酶），而其他生物体内的聚合酶），而其他生物体内的聚合酶在高温时会变性；聚合酶在高温时会变性； 3. pcr 3. pcr一般要经历三十多次循环，而一般要经历三十多次循环，而生物体内生物体内dnadna复制需要生物体自身的复复制需要生物体自身的复制制。 练习练习 ( (课堂检测课堂检测) ) 1 1、dnadna单链的单链的_末端为末端为3 3端端, , _末端为末端为5 5端端, ,在在dnadna复制时复制时, ,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,从引物的从引物的_端端, ,使子链向下延伸使子链向下延伸. . 2 2每次循环可以分为每次循环可以分为_这三个过程这三个过程, ,对应温度分别为对应温度分别为_._.磷酸基团磷酸基团羟基羟基羟基羟基dna聚合聚合3/变性、复性、延伸变性、复性、延伸9595、55 55 、72 72 9