国家自然科学基金申请书：口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选及其核酸

1、投送学科代码1c c03031102项h类别国家自然科学基金申请书项目名称：口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选及其核酸疫 苗的研究申请者:所在单位:邮政编码:通讯地址:电 话:传 真:申请h期:国家自然科学基金委员会填报说明一、填写巾请书前，请先查阅国家口然科学基金有关项目巾请办 法及规定。中请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明 确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一 次岀现的缩写词，须注出全称。二、屮请书为十六开本，复印时用b5复印纸，于左侧装订成册。 第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原 件），出所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国

2、家自然科学基 金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治 区）科委一份原件。三、封面上右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和 中报学科代码1由中请者填写。四、巾请者和项目组屮具冇高级专业技术职务的主要成员申请 （含参加）的项h数，连同在研的国家h然科学基金项口数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。五、同一申请者研究内容相近的项目，只允许报送一个科学部。六、申请者可因同类项口竞争等原因，提出不宜评议木项口的专 家名单（姓名与单位，3人以内），附另页于巾请书原件中，供科学部 选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。匕、国家自然科学基金委员会通信地址:北京海淀区花

3、园北路 35号东门邮政编码：100083、简表名屮 文口肺高转移关抗原基因的筛选及其杉1酸疫苗的研究研称英文screen and nucleic acid immunization of lung highly metastatic related antigen gene in oralcancer究类别a.自由屮请b.髙技术探索e垂大f.垂点c.h.青年d.专项地区c高技术探索 项目主题号项川报名称1口腔颌面外科学名称2a.基础研究目学科代码1c03031102代码2b.应用基础b申请金额所用实验室姓中文名拼音屮专业 技术 职务名称请代码所名称者在性质单位所在地总人数6b:姓名签字项要何荣

4、根成陈万涛邓永强目林李嵩周晓健组不含研 究 内 容 和 思 义摘要采用生物芯片技术对人腺样囊性癌的肺低转移细胞系及其高转移克隆株进行大规模的基因表达定量对比分析筛选鉴定肺高转移相关抗原基因设计构建同源的核酸疫苗建立动物模型运用分子外科转基因技术将核酸疫苗导入动物模型中分析其抗肿瘤免疫效果进一步阐明恶性肿瘤的肺转移机理寻找新的有效靶位点为防治癌转移提供新万法o主题词1.主题词数量不多于3个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）屮文肿瘤转移基因英文tumor / metastasis / gene简表填写要求一、简表内容将输入计算札 必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所冇代码以戢

5、新发布 的国家口然科学基金川请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新 构思课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类別也填写b,并在申请书封面右上角加 注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏忖,将和应提示符a、b等z填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称一应确切反映研究内容和范i丸最多不能超过25个汉字（包括标点符号）。菇础研究一指以认识自然现彖、探索自然规律为目的的，不肓接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究一指有广泛应用前景，但以获収新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。报审学科一屮请项忖所屈的授基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主

6、学科。申请金额一以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从巾请的次年的1月算起。完成时间为完成年度的12月。所用的实验室一系指研究项目将利用的实验室似填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的 开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填写 冲科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：航 空航天工业部七o-研究所。首次小请国家口然科学基金的单位，尚未编入单 位代码，其代码新不填。参加单位数一指研究项目组成员所在单位数，包括主持单位和合作单位，以阿拉们数字表示。项11组主耍成员一指在项h组内对学术思

7、想、技术路线的制定与理论分析及对项h的完成起主耍作用 的人员。木栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义一摘耍与主题词均录入软盘。二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要的参考文献及出处） 对某础研究，着垂结合国际科学发展趋势，论述项1=1的科学意义;对应用基础研究，着重结合科学前沿，围绕国民经济和社会发展中的重耍科技问题，论述 其应用前景。项目的科学意义恶性肿瘤肺转移的防治是临床上进一步提高患者生存率和治愈率的关键所在，具备 肺转移潜能的癌细胞亚群是肿瘤组织与宿主组织之间长期相互作用、相互选择的结果， 在此过程中，这些癌细胞亚群产生了不同于其它亚群的特点，包括转移相关

8、基因及由其 所决定的细胞和群体水平的特点，其中，肺高转移相关抗原基因是一个相当重要的方面 1,1,因而，筛选和鉴定肺高转移相关抗原基因，有助于深入理解和阐明肺转移的机制。 在此基础上，设计和构建有效的核酸疫苗，发展紧密结合临床实际的转染方法，激活机 体的特异性主动免疫，必将对杀伤肺高转移性癌细胞亚群，进而控制肺转移有十分重要 的意义。国内外研究现状分析迄今为止，与口腔癌侵袭转移相关的基因只局限在ps3c-erb-2nm23等少数几个基 因上，其根本原因在于以往的研究方法受到分子生物学技术的极大限制，只能研究单 个或少数几个基因。1996年，在人类基因组计划的研究中，steven fodor等以

9、充分结合 并灵活运用了计算机、dna合成、探针杂交、照相平板印刷、激光共聚焦扫描等技术， 创造了完整的dna生物芯片，可同时定量检测成千上万个基因的表达谱，结合生物信息学 可从整体上分析疾病。1998年，gress等采用含20,736个基因片段的dna芯片，检查了 胰腺癌细胞株、胰腺癌组织与对照胰腺组织的基因表达谱，发现胰腺癌存在129个新基因 序列和97个est,从而找出了形成胰腺癌恶性表型的相关基因。现阶段，国内已建立dna生物芯片技术和人腺样囊性癌细胞系acc-2及其肺高转移克 隆株acc-m，我们采用含14, 000个基因片段的dna生物芯片首次对遗传背景相同而生 物学行为不同的acc

10、-2和acc-m进行了大规模的基因表达定量对比分析，结果表明，低转 移性的acc-2细胞系和肺高转移性的acc-m细胞株比较，有显著差异的基因36个，有差 异的基因213个。这些基因涉及跨膜蛋白、细胞信号传导、细胞代谢过程等诸方面。其 中的肺高转移相关抗原基因可通过生物信息学分析、反义核酸、血小板凝集试验和裸小 鼠移植瘤肺转移模型来筛选和鉴定。对肿瘤抗原加工递呈过程和机体免疫反应的深入研究表明，影响肿瘤免疫治疗效果 不理想的重要原因在于肿瘤相关抗原是正常细胞中有或曾经有表达的蛋白质，只是在肿 瘤细胞中有不适当的表达，因而引起了机体的免疫耐受，为了克服免疫耐受, 1998年 disis等采用同源

11、的人her-2/neu蛋白免疫小鼠，诱导了比使用小鼠自身neu蛋白大 得多的机体免疫。同时发现不使用完整的肿瘤抗原，而只使用肿瘤抗原多肽片段，能更有 效地诱发机体免疫反应。但以上研究均采用的是肽疫苗，近年来发展的核酸疫苗因安全、 热稳定和能引发持久的细胞和体液免疫等特点，从而比肽疫苗更具发展潜力叫核酸疫苗集中了减毒疫苗和亚单位疫苗的优点，既可以不断表达抗原蛋白，又可以 克隆所需基因片段，以激发理想的免疫反应，国内外对以t细胞识别的肿瘤抗原为中心 的抗肿瘤核酸疫苗免疫治疗进行了大量的研究表明能诱发机体的抗肿瘤免疫反应， 杀伤癌细胞。但目前关于肺转移相关抗原核酸疫苗的研究尚未见报道。本研究在筛选鉴

12、定肺高转移相关抗原基因的基础上，设计构建同源的核酸疫苗，建 立癌细胞动物模型，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，研究其 抗肿瘤效果，将对深入理解肺转移的机制和临床外科治疗模式的发展产生积极影响（叫参考文献1. resser-jr; carbone-dp immunotherapy of head and neck cancercurr-opin-oncol. 1998 may; 10(3): 226-322 clayman-gl; frank-dk;et al adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer as a surgic

13、al adjuvant in advanced head and neck cancers clin-cancer-res. 1999 jul; 5(7):268-2713. strachan.t.abitbol.m, et al.a new dimension for the human genome project : towardscomprehensive maps. nature genetic. 1997,16:126-1314. gress t m, muller-pillasch f, et al. a pancreatic cancer-specific expression

14、 profile .oncogene,!998,13:1819-18305. 关晓峰，邱蔚六等.肺高转移性腺样囊性癌细胞株的筛选.中华口腔医学杂志，1996; 2: 74-77.6mldisis，f.m shiota etb al human her-2/neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu :a vaccine strategy for self tumor antigens .immunology . 1998,93:192-199.7 seder, robert a.; gurunathan, sanjay.

15、dna vaccines: designer vaccines for the 21st century the new england journal of medicine999;341(4):277279s.ciernik if,berzofsky ja et al .induction of cytotoxic t lymphocytes and antitumor immunity with dna vaccines expressing single t cell epitops. j immunol 1996,156:2369-23759.gary l .clayman, ade

16、l k.ei-naggar et al in vivo molecular therapy with p53 adenovirus for microscopic residual head and neck squamous carcinoma.cancer research,1995;55:1-6.1().jack a.roth .molecular surgery for cancer. arch surg. 1992; 127:1298-1302.三、研究方案1研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：已建立人腺样囊性癌细胞系acc-2及其肺高转移性克隆株acc-m,采用dna生物

17、芯片 技术对这两个遗传背景相同而生物学行为不同的癌细胞系的基因表达谱进行定量对比 扫描，运用生物信息学、反义核酸技术、分子杂交来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因， 同时建立癌细胞动物模型，设计构建与口腔癌肺高转移相关抗原基因序列同源的核酸 疫苗，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，深入研究其抗肿瘤免 疫效果。研究内容1. 运用dna生物芯片技术（含14, 000个基因）对腺样囊性癌细胞系acc-2及其肺高 转移性克隆株acc-m进行大规模的基因表达谱定量对比分析。2结合生物信息学的聚类分析和同源分析、反义核酸技术、血小板凝集试验、裸 小鼠移植瘤肺转移模型来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因

18、，通过rt-pcr和分子杂交进 一步在临床手术标本和其它口腔癌细胞系中确证.3. 选用含巨细胞病毒（cmv）启动子和（3-gal基因的真核表达载体，设计构建与肺 高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗。4. 建立癌细胞动物模型，应用分子外科转基因方法，通过荷瘤动物模型的cox生存 分析、t细胞亚群功能测定、抗|3-gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤效应的强度.拟解决的关键问题：1对dna芯片所获得的大量基因信息进行有效的分析筛选和鉴定。2. 核酸疫苗的设计。3. 抗肿瘤效应的分析。2拟采用的研究方法、技术路线、实验方案及对行性分析实验方案和研究方法1. 分别培养人腺样囊性癌细胞系acc-2及其肺高转移

19、克隆株acc-m,抽提总rna,分 离mrna,逆转录成cdna并用p”标记.2. 制备cdna阵列膜片，包含约14,000个基因，每个基因的序列已测出，分别与标记的 cdna片段杂交，采用专用软件和生物信息学分析基因表达量的差异。3. 运用生物信息学的聚类分析、同源分析和各种基因库信息对有差异的基因进行初 步筛选，采用反义核酸技术，结合细胞学试验、血小板凝集试验和腺样囊性癌裸小 鼠移植瘤肺转移模型，鉴宏初步筛选的靶基因在细胞生长和转移中的作用，通过 rt-pcr和分子杂交进一步在临床手术标本和其它口腔癌细胞系中确证。4. 通过国际互联网查询美国国立卫生研究院（nih）的生物信息科技中心（nc

20、bi）,可获 得与靶基因不同同源度的序列，据此选用含巨细胞病毒（cmv）启动子和|3-gal基 因的真核表达载体，设计构建与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗。同时，查 找含相同序列的鼠癌细胞系，并从中科院上海细胞所细胞库中获取相应的鼠癌细 胞系，在小鼠（非裸鼠）上种植癌细胞建立癌细胞鼠模型。5. 利用已建立的分子外科缝线和注射转基因的方法，将核酸疫苗转入癌细胞鼠模型 中，通过荷瘤鼠模型的cox生存分析、t淋巴细胞亚群分析、抗3-gal抗体测定来 研究其体内抗肿瘤的效应，从中找出最有效的抗肿瘤作用因子.可行性分析1. 本实验室长期从事腺样囊性癌肺转移机理及其防治的研究，积累了丰富的理论知识 和

21、实验经验，并取得了公认的成就.2. 已进行的预初试验表明，肺低转移性的acc - 2细胞系和肺高转移性的acc-m细胞 株比较，已发现有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。3. 申请者本人在攻读研究生期间致力于肿瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，该研究首 次将含报告基因的质粒导入兔舌肌和胸锁乳突肌，建立了分子外科转基因技术。并 已熟练掌握分子克隆和基因重组技术.4. 实验所需的基因分析软件、真核表达载体质粒、免疫分析试剂等已具备3.本项h的创新z处1. 首次采用dna芯片对遗传背景相同而生物学行为不同的口腔癌细胞进行大规模的基 因定量对比分析。2. 筛选和鉴定新的肺高转移相关抗原基因.3.

22、 本研究设计构建了与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗，深入研究了其抗肿瘤 免疫作用.技术路线:低转移细胞系acc-2和肺高转移性克隆株acc-m抽提总rna,分离mrna,逆转录成cdna, p”标记.dna芯片技术（含14, 000个基因）的基因表达谱定量对比扫描分析生物信息学 聚类和同源分析v反义核酸技术、血小板凝集试验腺样囊性癌裸小鼠移植瘤肺转移模型鉴定rt-pcr和分子杂交进一步确证v肺高转移相关抗原基因1iit1设计构建同源核酸疫苗建立癌细胞鼠模型将核酸疫苗转入癌细胞鼠模型中cox生存分析、t淋巴细胞亚群分析抗|3-gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤效应4. 年度研究计划及预期进展1

23、. dna芯片技术对低转移性的acc - 2细胞系和肺高转移性克隆株acc - m细胞株的基 因的大规模扫描分析.2. 肺高转移相关抗原基因筛选。肺高转移相关抗原基因的分析和鉴定。1. 构建核酸疫苗。1. 建立癌细胞动物模型。2. 测定分析抗肿瘤效应。5. 预期研究成果5. 预期研究成果1. 获得人腺样囊性癌细胞系acc-2及其肺高转移性克隆株acc-m二者完整的基因表达 差异谱。2. 口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定。3. 核酸疫苗抗肿瘤方法的应用。4. 在国内、外专业刊物上发表论文5-6篇，参加国际、国内会议交流2-3次。四、研究基础1. 与木项口有关的研究工作积累和已取得的研究工作

24、成绩12. 预初实验结果表明，肺低转移性的acc - 2细胞系和肺高转移性的acc - m细胞株比 较，有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。这些基因涉及细胞信号传导、 细胞代谢过程、跨膜蛋白等诸方面，为进一步进行肺高转移相关抗原基因的筛选 和鉴定及核酸疫苗的设计提供了宝贵的数据。3. 申请者本人在攻读研究生期间致力于肿瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，该研究 首次将含报告基因的质粒导入兔舌肌和胸锁乳突肌中，建立了分子外科转基因技 术。并已熟练了掌握分子克隆和基因重组技术.2. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部 门开放实验室的计划和落实情况）1.

25、 口腔肿瘤生物实验室具备细胞生物学和分子生物学的各项有关设备，包括达到 gfp标准的细胞培养室、进口培养箱、无菌标准操作台、低温超高速离心机、-80 °c低温冰箱、pcr扩增仪、核酸蛋白分析仪等。2. 拥有dna芯片分析的全套设备，包括96孔板和384孔板、pcr仪自动点膜仪、信 号扫描仪、杂交炉等。3. 建有达spf标准的实验动物中心。主要预初实验结果1. dna芯片对肺低转移性的acc-2细胞系和肺高转移性克隆株acc-m细胞的 14,000个基因的定量对比扫描分析结果表明，有显著差异的基因36个，有差异的 基因213个。下面列出的是部分显著差异基因的基因序列号及其相关信息。2.

26、 这些基因涉及细胞信号传导、细胞代谢过程、跨膜蛋白等诸方面，为肺高转移 相关抗原基因的筛选和核酸疫苗的设计提供了可靠的数据和坚实的基础。hs.201967cds=(26,997) /gb=u05861 /gi=487134 /ug=hs. 201967 /len=1222hs.79748cds=(lll, 1700) /gb=ab018010 /gi=5926733 /ug=hs. 79748 /len=1879hs.183698cds=(29, 508) /gb=z49148 /gi=793842 /ug=hs.183698 /len=630hs.111515gb=aa484881 /gi二

27、2213948 /u萨ils. 111515 /len二436hs.78183cds=(51, 1022) /gb=d17793 /gi=457407 /ug=hs. 78183 /len=1204hs.255772clone end=5' /gb=aa186737 /gi = 1774854 /ug=hs. 255772 /len=511hs.58593cds=(119, 868) /gb=x16901 /gi=35864 /ug=hs. 58593 /len=1408hs.75069cds=(0, 1451) /gb=u23143 /gi=746435 /ug二hs. 75069

28、/lcn=1452hs. 150741clone_end二3' /gb=aw072071 /gi二6027069 /ug二ils. 150741 /len=467hs.109798cds=(41,421) /gb=aj249732 /gi二5921472 /ug=hs.109798 /len=711hs.14779clone end=3，/gb=n64822 /gi=1212651 /ug=hs. 14779 /len=636hs.132390cds=(0,977) /gb=u09848 /gi=495567 /ug=hs. 132390 /len=3505hs.43800clone_

29、cnd=5，/gb=w20128 /gi=1295998 /ug=hs. 43800 /lcn=526hs.241829clone_end二3' /gb=a1254779 /gi二3862304 /ug二ils. 241829 /len二359hs. 71819clone_end=3， /gb=a1005336 /gi二3214846 /ug=hs.71819 /len-685hs. 189083clone end=3， /gb=aa582554 /gi=2359914 /ug=hs. 189083 /lcn=461hs. 123057cds=(l1,385) /gb=x84003 /

30、gi=791052 /ug=hs. 123057 /len=413hs. 177687cds=(7,978) /gb=s68287 /gi=544761 /ug=hs.177687 /lcn=1167hs. 50966cds=(118, 4620) /gb二d90282 /gi二219552 /ug=iis. 50966 /len二5215ils. 76686cds=(320, 925) /gb=y00483 /gi=31918 /ug=hs. 76686 /len=1136hs. 18136cds=(143, 3403) /gb=u40490 /gi = 1110519 /ug=hs. 18

31、136 /len=42323中请者和项h组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项冃有关的主耍论 著目录切i获得学术奖励悄况及在本项目中承担的任务;青年科学基金屮请者还应注明 学位论文名称及导师姓名与工作单位*论文：作者题h刊名年份卷（期）贝码 专著：作者书名出版者年份12 -13 -五、经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由1 .合计16.002.科研业务费2.000. 50办公用品0. 50学术交流及会议费用0. 40科研成果鉴定0. 40资料检索、复印和论文打印、幻灯等0. 2 0论文发表、版面、审稿费3.实验材料费12. 004.00分子生物学试剂4.00生化分析试剂1.00

32、免疫分析试剂1.00普通试剂1.00基因库查询及软件分析费1. 00实验动物4 .仪器设备费1.001.00仪器设备添置费5 协作费0.50科研协作6.管理费0.50科研管理、水电费注：预算支出科目按卜列顺序填写：1 科研业务费2实验材料费3仪器设备费4实验室改装费六、申请者正在承担的其它研究项目（包括攀登讥划、863订划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止 年月、负责或参加等情况）七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况对中请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况、后 续研究进

33、展及与本川请项h的关系加以详细说明。另附该已结题项忖研究工作总结摘 要（300字）及已发表主要相关论文首页复印件 邙从三篇）。八、申请者承诺我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与木项kl组成员将严格遵导国家自然科 学基金委员会的有关规定，切实保证研究t作时间，按计划认真开展研究t作，按时报送有 关材料。中请者（签章）九、推荐意见（不具冇高级专业技术职务的申请者，须冇两名具冇高级专业技术职务的同行专家推荐。 推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项ii组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究 条件等。项li组成员不能做推荐者）采用国际先进的dna生物芯片技术，立足国内的遗传资源，黄丹博士后对人腺 样囊性癌低转移细胞系acc-2与其肺高转移克隆株